Study of the influence of lipid rafts in acetic acid-induced apoptosis

Dissertação de mestrado em Genética MolecularLipid rafts are sphingolipid-sterol rich micro-domains of the plasma membrane that have been associated with different cellular processes, including apoptosis. During the past years, yeast has been successfully established as a model to study mechanisms of programmed cell death in mammalian cells. Saccharomyces cerevisiae commits to cell death showing typical hallmarks of metazoan apoptosis in response to different stimuli. Gup1p, a pleiotropic O-acyltransferase first associated with glycerol metabolism and transport, is involved in lipid metabolism, rafts integrity and assembly, as well as in GPI anchor remodeling, among a wide range of cellular processes. While Gpd1p/Gpd2p are the two isoforms of glycerol-3-phosphate dehydrogenase that have a prime role in the production of glycerol, Rvs161p is a lipid raft protein mainly involved in the regulation of actin cytoskeleton polarization and secretory vesicle trafficking. Actin cytoskeleton together with vesicle trafficking have been suggested to play a crucial role in yeast apoptosis. Therefore, it is conceivable that lipid rafts may also play a role in yeast cell death and understanding their function in such process in yeast may provide further insights on their role in mammalian apoptosis. For this purpose we used two known apoptosis inducing conditions, chronological aging and acetic acid, and analyzed several apoptotic markers in Δgup1, Δgpd1Δgpd2 and Δrvs161 mutant strains. We found that Δgup1 presents a significantly reduced chronological life span as compared to Wt and is also highly sensitive to acetic acid treatment. According to the apoptotic markers analyzed, cells lacking GUP1 seem to be incapable of undergoing apoptosis. Instead this mutant appears to be experiencing a necrotic cell death process. The Δgpd1Δgpd2 (but not single mutants) and Δrvs161 mutant strains are also sensitive to acetic acid. However, the apoptotic markers examined suggest that these mutants die by apoptosis, differently from that we observed for gup1 mutant. The ergosterol distribution in Wt and in the acetic acid-sensitive mutant strains gup1, Δgpd1Δgpd2 and Δrvs161 was subsequently observed by filipin staining. An altered ergosterol distribution was visualized in all mutants studied, particularly in gup1 mutant. We also observed that acetic acid induces a rearrangement in the distribution of ergosterol. Altogether, our results indicate that lipid rafts seems to be a key component in apoptotic induction/signaling, probably even essential in some circumstances for the correct development of apoptosis in yeast.Os rafts, domínios da membrana plasmática ricos em esfingolípidos e ergosterol, têm sido associados com diversos processos celulares, incluindo a apoptose. Nos últimos anos, a levedura tem sido aceite como um bom modelo para o estudo dos mecanismos de regulação da morte celular programada. Vários estudos demostraram que, em resposta a diferentes estímulos, a levedura Saccharomyces cerevisiae apresenta uma morte celular com os fenótipos típicos da apoptose de mamíferos. A proteína Gup1p, uma O-aciltransferase anteriormente associada com o metabolismo e transporte de glicerol, está envolvida, de entre vários processos, no metabolismo lipídico, na arquitectura/integridade dos rafts, assim como na remodelação das âncoras GPI. As proteínas Gpd1p/Gpd2p são duas isoformas da glicerol-3-fosfatodesidrogenase, enzima responsável pela produção do glicerol. O Rvs161p é uma proteína dos rafts envolvida na regulação da polarização da actina e no tráfego de vesículas. Os filamentos de actina assim como o trafego de vesículas têm sido apontados como importantes intervenientes na apoptose em leveduras. Assim, é possível que os rafts exerçam um papel importante na morte celular em leveduras. O conhecimento da sua função neste processo poderá ajudar a compreender a importância dos rafts neste tipo de morte celular em mamíferos. Para estudar esta hipótese, foram analisados diferentes marcadores apoptóticos nos mutantes Δgup1, Δgpd1Δgpd2 e Δrvs161, em duas condições indutoras de apoptose, o envelhecimento cronológico e o tratamento com ácido acético. Verificamos que, quando comparado com a Wt, este mutante apresenta uma redução significativa na longevidade sendo também extremamente sensível ao ácido acético. Os marcadores apoptóticos estudados indicam que as células deletadas no gene GUP1 são incapazes de morrer por apoptose. Nas condições mencionadas, a estirpe Δgup1 parece morrer por necrose. Os mutantes Δgpd1Δgpd2 (mas não os mutantes simples) e Δrvs161 são também sensíveis ao ácido acético. Contrariamente ao que se observou para o mutante gup1, estes mutantes morrem por apoptose. Por último, examinou-se a distribuição do ergosterol nos mutantes sensíveis ao ácido acético. Observou-se alterações na sua distribuição em todos os mutantes, particularmente o mutante gup1. Verificou-se também que o tratamento com ácido acético induz um reorganização da distribuição do ergosterol. De um modo geral, os resultados obtidos sugerem que os rafts exercem uma função determinante na indução/sinalização da apoptose, sendo portanto, a sua integridade essencial no desencadear do processo apoptótico.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Projeto da FCT (FCOMP-01-0124-FEDER-007047