Characterization of the role of sphingolipids in the modulation of acetic acid-induced apoptosis

Dissertação de mestrado em Genética MolecularThe yeast Saccharomyces cerevisiae can undergo programmed cell death in response to different stimuli. Exposure of yeast cells to acetic acid has been shown to trigger a mitochondrial pathway displaying, as in mammalian cells, typical apoptotic markers such as externalization of phosphatidylserine, DNA fragmentation, chromatin condensation, mitochondrial dysfunction with cytochrome c release and production of reactive oxygen species (ROS). Sphingolipids are lipid second messengers generated in response to different physiological signals and stress stimuli. They affect multiple aspects of cellular function, including apoptosis. Changes in sphingolipid metabolism have been linked to apoptosis and oxidative stress in both yeast and mammalian cells. The increase of ceramide and sphingosine levels leads to cell growth arrest and apoptosis whereas the increase of sphingosine-1-phosphate levels promotes proliferation and inhibits apoptosis. Moreover, ceramides have been detected in mitochondria and accumulate upon stress treatments, increasing the permeability of the mitochondria to cytochrome c and leading to the generation of ROS. Our working hypothesis was that acetic acid may elicit ceramide production and, therefore, may trigger apoptosis by a signal transduction pathway modulated by ceramide. For that reason, we aimed to characterize the relative contribution of biosynthesis versus catabolism of ceramides to the apoptotic cell death induced by acetic acid in yeast. For our studies, yeast cells lacking Lag1p, Lac1p (unable to generate ceramide by de novo synthesis), Ydc1p and Ypc1p (unable to breakdown ceramide) and Isc1p (unable to generate ceramide by degradation of inositolphosphosphingolipids), were generated by homologous recombination. Our results showed that lag1Δ and isc1Δ mutant cells exhibited a higher resistance to acetic acid that was correlated with lower levels of ROS production and reduced mitochondrial alterations. In comparison with the wild-type strain, lag1Δ and isc1Δ mutant cells display, under acetic acid stress, lower levels of mitochondrial fragmentation and degradation, and reduced alterations of the mitochondrial membrane potential. Associated with these events, there was also less translocation of cytochrome c to the cytosol in response to acetic acid than in the wild-type strain. In conclusion, our results suggest that ceramide production contributes to cell death induced by acetic acid, especially through the hydrolysis of complex lipids catalyzed by Isc1p and through de novo synthesis catalyzed by Lag1p.A levedura Saccharomyces cerevisiae pode sofrer morte celular programada em resposta a diferentes estímulos. O tratamento de células de levedura com ácido acético tem sido descrito como capaz de ativar a via mitocondrial apresentando, exposição de marcadores celulares típicos de apoptose de mamíferos tais como externalização de fosfatidilserina, fragmentação de DNA, condensação da cromatina, disfunção mitocondrial, incluindo a libertação de citocromo c, e produção de espécies reativas de oxigénio (ROS). Os esfingolípidos são lipídos mensageiros gerados em resposta a diferentes sinais fisiológicos e estímulos de stress. Alterações no metabolismo de esfingolípidos têm sido associadas a apoptose e stress oxidativo tanto em leveduras como em células de mamíferos. O aumento dos níveis de ceramidas e esfingosina promove a paragem do crescimento celular e a apoptose, enquanto o aumento dos níveis de esfingosina-1-fosfato promove a proliferação e inibe a apoptose. Adicionalmente, tem-se verificado a deteção e acumulação de ceramidas nas mitocôndrias após tratamentos de stress, aumentando a permeabilidade da mitocôndria ao citocromo c e levando à produção de ROS. A hipótese de trabalho deste projeto consistiu na suposição de que o ácido acético pode levar à produção de ceramidas e portanto, desencadear a apoptose por via de transdução de sinal modulado por ceramida. Por essa razão, foi nosso objetivo caracterizar a contribuição relativa da biossíntese e do catabolismo de ceramidas para a morte celular por apoptose induzida por ácido acético na levedura. Mutantes de levedura deficientes nas enzimas Lag1p e Lac1p (incapazes de gerar ceramidas pela síntese de novo), Ydc1p e Ypc1p (incapazes de catabolizar ceramidas) e Isc1p (incapaz de gerar ceramidas pela degradação da inositolfosfoesfingolípidos), foram gerados por recombinação homóloga. Os resultados mostraram que os mutantes lag1Δ e isc1Δ exibem uma maior resistência ao ácido acético que se correlaciona com níveis baixos de produção de ROS e alterações mitocondriais menos intensas. Em comparação com a estirpe selvagem, lag1Δ e isc1Δ exibem, sob stress de ácido acético, menores níveis de fragmentação e degradação mitocondrial e reduzidas alterações do potencial de membrana mitocondrial. Associados a estes eventos, observou-se igualmente uma menor translocação de citocromo c para o citosol do que na estirpe selvagem. Em conclusão, os resultados sugerem que a produção de ceramidas contribui para a morte celular induzida por ácido acético, especialmente através da hidrólise de lípidos complexos catalisada por Isc1p e através de síntese de novo catalisada por Lag1p