Optimization of transient expression procedures in Catharanthus roseus and Arabidopsis thaliana for subcellular localization studies

Dissertação de mestrado em Biotecnologia e Bio-Empreendedorismo em Plantas Aromáticas e MedicinaisNowadays, the availability of much gene sequence information demands the development of tools for their fast characterization at the protein level, where function actually resides. Here, the interest in the characterization of certain of the known Arabidopsis class III peroxidase (Prx) genes, as well as the interest in the characterization of candidate genes implicated in the metabolism of the anticancer terpenoid indole alkaloids of Catharanthus roseus, has led to the need of establishing transient expression procedures for these two species. Therefore, the main goal of this work was the development and optimization of simple/fast, efficient and reproducible transient expression protocols for subsequent subcellular localization studies of proteins coded by Prx genes, and for characterization of candidate genes provided from omic approaches, namely implicated in the regulation, biosynthesis or transport of the valuable alkaloids from C. roseus. A complementary goal was to investigate the subcellular localization and sorting determinants of Prxs, namely the vacuolar sorting capacity of a C-terminal amino acid sequence extension (CTE) present in vacuolar Prxs, using as examples the well characterized and most abundant vacuolar Prx from C. roseus leaves, CrPrx1, and the most abundant Prx in the leaves of Arabidopsis, AtPrx34. For this, already available CrPrx1-GFP fusions and newly generated AtPrx34-GFP fusions were used in the transient expression assays. The successful establishment of protocols for PEG-mediated transformation of both Arabidopsis and C. roseus mesophyll protoplasts was achieved and validated as excellent transient expression systems. Transient expression by Agrobacterium infiltration of Arabidopsis and C. roseus leaves was also attempted, but it was only successful with in vitro C. roseus plants. However, promising insights were made into the development of this technique. Expression of CrPrx1-GFP fusions in Arabidopsis and C. roseus protoplasts using the established protocols confirmed the vacuolar localization of this Prx. Additionally the CrPrx1 signal peptide (SP) and CTE were confirmed as sorting determinants that target GFP to the ER and vacuole, respectively. The characterization of the subcellular localization and sorting determinants of AtPrx34 was not elucidated, possibly due to malfunctioning of the vector plasmid used for protoplast infiltration. In fact, upon agroinfiltration of in vitro C. roseus plants, it was possible to observe sorting to the ER of an SPAtPrx34-GFP fusion coded by a construct harboured in a binary vector plasmid, different from the one used for protoplast transformation. Thus, a resolution of the subcellular sorting of AtPrx34 should be possible in the near future. The transient expression assays described in the present study were highly reproducible, resulted in very satisfactory transformation efficiencies, and constitute a reliable and inexpensive methods that can be performed in most labs, and that are suitable test-systems to characterize genes of unknown function. This is also the the first time a transient expression system for C. roseus protoplasts is reported, using a PEGmediated transformation protocol.Actualmente, a disponibilidade de inúmeras sequências genómicas exige o desenvolvimento de ferramentas para uma rápida caracterização ao nível protéico, onde de facto reside a função. Neste trabalho a caracterização de determinados genes de Peroxidases de Classe III (Prx) de Arabidopsis, assim como o interesse na caracterização de possíveis genes envolvidos no metabolismo de alcalóides indólicos terpenóides anticancerígenos de Catharanthus roseus, impulsionou a necessidade de estabelecer procedimentos de expressão transiente para estas duas espécies. Consequentemente, o objectivo principal deste trabalho foi o desenvolvimento e optimização de protocolos de expressão transiente simples/rápidos, eficientes e reproduzíveis para estudos de localização subcelular de proteínas codificados por genes Prx, e para a caracterização de possíveis genes obtidos de abordagens omicas, nomeadamente implicados na regulação, biossíntese ou transporte de alcalóides relevantes de C. roseus. Como objectivo complementar investigar a localização subcelular e sinais de direccionamento de Prxs, designadamente a capacidade de direccionamento vacuolar da extensão C-terminal aminoacídica (CTE) presente em Prxs vacuolares, utilizando como exemplos a Prx vacuolar mais abundante e estudada presente nas folhas de C. roseus, Crprx1, e a Prx mais abundante nas folhas de Arabidopsis, AtPrx34. Para tal, fusões CrPr1-GFP já disponíveis e fusões AtPrx34-GFP recém geradas foram utilizadas em procedimentos de expressão transiente. O estabelecimento com sucesso de protocolos de transformação mediada por PEG para protoplastos de mesófilo de Arabidopsis e C. roseus foi alcançado e validado como um excelente sistema de transformação transiente. Transformação transiente por infiltração com Agrobacterium de folhas de Arabidopsis e C. roseus foi abordado, mas apenas foram obtidos resultados positivos com plantas de C. roseus in vitro. Todavia progressos promissores foram realizados para o desenvolvimento desta técnica. Expressão de fusões CrPrx1-GFP em protoplastos de Arabidopsis e C. roseus utilizando os protocolos estabelecidos confirmaram a localização vacuolar desta Prx. Adicionalmente o péptido sinal (SP) e a extensão C-terminal (CTE) de CrPrx1 foram confirmados com sinais determinantes que direccionam a GFP para o RE e o vacúolo, respectivamente. A caracterização da localização subcelular e sinais de direccionamento de AtPrx34 não foram elucidados, possivelmente devido a uma irregularidade funcional do vector plasmídeal utilizado na transformação de protoplastos. De facto, após agroinfiltraçao de plantas C. roseus in vitro, foi possível observar o direccionamento para o RE da fusão SPAtPrx34-GFP codificada por um constructo incluído em vector binário, diferente do vector utilizado na transformação de protoplastos. Portanto, a caracterização do direccionamento subcelular da AtPrx34 poderá ser possível num futuro próximo. Os procedimentos de expressão transiente descritos no presente estudo manifestaram-se bastante reproduzíveis, resultando em níveis satisfatórios de eficiência de transformação, e constituem métodos fidedignos e de baixo custo que podem ser realizados na maioria dos laboratórios, e são sistemas-teste convenientes para caracterizar genes de função desconhecida. Foi também reportado pela primeira vez um sistema de transformação transiente em protoplastos de C. roseus, utilizando um protocolo de transformação mediada por PEG. Palavras-chave: Catharanthus roseus, Arabidopsis, transformação mediada por PEG, Agroinfiltração, fusões-sGFP, localização subcelular, via secretora, sinais de direccionamento, vacúolo, microscopia confocal