Construção de ferramentas moleculares para o estudo das proteínas arabinogalactânicas AGP6 e AGP11 de Arabidopsis thaliana

Dissertação de mestrado em Fisiologia Molecular de PlantasUm dos mais significativos marcos na evolução das plantas vasculares é o surgimento de plantas com flor, que trouxe consigo estratégias evolutivamente favoráveis: o óvulo protegido por dois tegumentos e encerrado num pistilo que atrai, retém e direcciona os gâmetas masculinos. No entanto, a reprodução sexuada das Angiospérmicas apresenta ainda alguns mistérios que só recentemente começaram a ser desvendados. O grão de pólen, ao longo do seu desenvolvimento, apresenta notáveis diferenças no transcriptoma das diferentes fases. No estado maduro, o transcriptoma do grão de pólen apresenta elevada expressão maioritariamente dos genes envolvidos em sinalização e alongamento celular, genes que serão importantes na germinação e desenvolvimento do tubo polínico, e direccionamento para o gametófito feminino. As proteínas arabinogalactânicas (AGPs) são glicoproteínas ricas em hidroxiprolina altamente glicosiladas por cadeias de arabinogalactano tipo II implicadas em vários estudos realizados ao longo das últimas duas décadas em vários processos importantes do desenvolvimento vegetal. Têm suscitado particular interesse pela sua presença marcante e específica nos tecidos dos órgãos florais, observada em estudos de imunocitoquímica e análise de transcriptomas, levantando suspeitas sobre um possível papel relevante na reprodução sexuada. Neste estudo pretendeu-se colocar em foco as proteínas arabinogalactânicas clássicas AGP6 e AGP11, expressas exclusivamente no grão de pólen, introduzindo em cada uma destas proteínas uma sequência c-myc que permita efectuar a sua localização específica nas células em plantas de Arabidopsis thaliana selvagem e mutante nulo agp6agp11, para futuramente proceder a estudos de análise fenotípica e funcional. Pretendeu-se também fundir cada uma das AGPs com o promotor CaMV 35S para obter uma sobrexpressão de tal ordem que seja possível obter proteína em quantidades manipuláveis para estudos bioquímicos. O estudo destas linhas de plantas transgénicas ajudará a compreender a função destas duas proteínas no grão de pólen, e a sua importância no processo de dupla fecundação. A capacidade de purificar individualmente cada proteina será igualmente um importante avanço para o estudo bioquímico não só da AGP6 e da AGP11, mas também de outros membros da família das proteínas arabinogalactânicas.One of the most significant achievements in tracheophyte evolution is the development of flowers, which brought along several beneficial evolutionary strategies: the ovule is protected by two integuments and enclosed in a pistil that attracts, retains and directs the male gametes. However, the sexual reproduction of Angiosperms still presents a few enigmas that to this day are being slowly uncovered. The pollen grain, throughout its development, shows significant differences in the transcriptome of the different stages. In the mature state of the pollen grain, the transcriptome shows an outstanding up-regulation of the genes associated with signaling and cell elongation, genes which will be important later on, for the germination of the pollen tube and guidance into the female gametophyte. Arabinogalactan proteins (AGPs) are hydroxiproline-rich glycoproteins highly glycosylated by chains of type II arabinogalactan, which have been implicated in several studies performed in the past two decades as participants of numerous major processes of plant development. They are intriguingly present in a very specific manner during the development of floral tissues, both in immunocytochemistry assays and transcriptome analysis, having thus given rise to suspicions about a putative relevant role in sexual reproduction. The present work intended to put in to focus the classic arabinogalactan proteins AGP6 and AGP11, exclusively expressed in the pollen grain, introducing in each one a c-myc tag that will allow for its specific subcellular localization in wild type Arabidopsis thaliana, as well as in double null agp6agp11 mutants, for studies of phenotype and function. It was also proposed to fuse each of these AGPs with the CaMV 35S promoter in order to obtain overexpression in such a way that the amount of extractable protein will allow further biochemical assays. Future study of these transgenic lines will aid in understanding the role of these proteins in the pollen grain, and their importance in the double fertilization process. The ability to purify each individually will also be an important advancement for the biochemical study of not only AGP6 and AGP11, but also of the other members of the AGP family