Clonagem e expressão de péptidos antimicrobianos e a sua avaliação

Dissertação de mestrado em Genética MolecularThe extensive and inappropriate use of chemical antibiotics has led to development of resistance in pathogens. The antimicrobial peptides (AMPs) arise as a good alternative to traditional pharmaceutical agents. They exhibit a broad range of antimicrobial, antitumoral or antiviral activities. AMPs are usually small, cationic molecules that occur as part of the innate defense mechanism in many organisms, even in microbes and viruses. The present works describe a new strategy for the production of two soluble recombinant antimicrobial peptides in Escherichia coli: ABP-CM4 and BMAP-28, from Bombyx mori (silkworm), and Bos taurus (cow), respectively. In an attempt to overcome the production problems related to the toxicity of the AMPs to the producer cell, the new strategy exploits the increasing interest of elastin-like polymers (ELPs) properties. ELPs are repetitive polypeptides inspired on the mammalian elastin structure which consists of a pentapeptide repeat, VPGXG. One of the most interesting features of the ELPs is their Inverse Temperature Transition (ITT) behaviour. The recombinant ELP used is based on repetitions of the main monomer VPAVG, which displays thermoresponsive properties, hysteresis behaviour and no measurable cytotoxicity. The production of the genetic construction to ABP-CM4 was achieved in E. coli BL21(DE3) and the properties of the pure hybrid biomaterial were evaluated, both in terms of the physical and chemical characteristics and the antimicrobial and antifungal activity. For BMAP-28 the productions proved very inconstant and further studies are needed to understand these production problems.O uso extensivo e inapropriado de antibióticos químicos levou ao aparecimento de novos e cada vez mais graves agentes patogénicos resistentes a estes fármacos, usados como primeira e principal linha de defesa contra estres agressores. Os péptidos antimicrobianos (AMPs – Antimicrobial Peptides) surgem como uma boa alternativa para os tradicionais fármacos, já que demonstram uma actividade antimicrobiana, antitumoral ou até antifúngica, de largo espectro. Os AMPs são geralmente péptidos catiónicos que ocorrem como parte da defesa inata de grande parte dos organismos, inclusive em bactérias e vírus. O presente trabalho descreve uma nova estratégia para a produção de dois AMPs recombinantes: ABP-CM4 e BMAP-28, encontrados em Bombyx mori (bicho-da-seda), e Bos taurus (vaca), respectivamente. Numa tentativa de ultrapassar os problemas de produção heteróloga em bactéria, relacionados com a toxicidade dos AMPs para a célula produtora, esta nova estratégia explora as interessantes propriedades dos polímeros semelhantes à elastina (ELP – elastin-like polymers) que têm sido alvo de um crescendo de interesse na investigação e aplicações biotecnológicas. Os ELPs são sequências polipeptídicas repetitivas inspiradas na estrutura da elastina de mamífero de uma repetição penta-peptídica, VPGXG. Uma das características mais interessantes dos ELPs, e que vai ser explorada no presente trabalho, é a sua temperatura de transição inversa (ITT - Inverse Temperature Transition). O ELP recombinante usado no decorrer do trabalho é baseado na repetição do monómero VPAVG, que apresenta propriedades termorresponsíveis, comportamento de histerese e ausência de citotoxicidade. A produção da construção genética contendo o péptido ABP-CM4 foi obtida em Escherichia coli BL21(DE3) e o material , após purificação, foi caracterizado quanto às suas propriedades físico-químicas e quanto à da sua actividade antimicrobiana e antifúngica. Relativamente ao péptido antimicrobiano BMAP-28, as produções foram pequenas e revelaram-se bastante inconstantes pelo que apenas com estudos futuros se poderão revelar a causa destes problemas