Fragrâncias vegetais com actividade anti-insecto : óleos essenciais de Lavandula angustifolia P. Mill., Foeniculum vulgare Mill., Petroselinum crispum (Mil.) A.W. Hill e Anethum graveolens L. e suas actividades contra Anopheles atroparvus van Thiel, 1927 (Diptera, Culicidae)

Dissertação de mestrado em Biotecnologia e Bio-empreendedorismo em Plantas Aromáticas e MedicinaisA actividade insecticida ou insecto-repelente de óleos essenciais (OEs) de plantas aromáticas e seus constituintes (compostos terpenóides e fenilpropanóides) são largamente reconhecidas. (Regnault- Roger, 1997). Este potencial anti-insecto deve-se essencialmente à relativa simplicidade química dos constituintes voláteis e especificidade dos seus modos de acção ao nível de alguns receptores dos insectos (Isman e Akhtar, 2007; Shaaya e Rafaeli, 2007). As espécies das famílias Lamiaceae e Apiaceae são fontes de compostos com potencial actividade insecto-tóxica. Assim, procurou-se caracterizar os OEs extraídos de diferentes partes de plantas in vivo e plântulas in vitro de Lavandula angustifolia (alfazema), Foeniculum vulgare var. vulgare (funcho amargo), Petroselinum crispum spp. neapolitanum (salsa de folha lisa) e Anethum graveolens (aneto). Paralelamente, foi planeada a avaliação da actividade anti-insecto dos OEs contra o mosquito Anopheles atroparvus (Diptera, Culicidae), um importante vector da Malária na Europa, especialmente em Portugal. A primeira fase da investigação consistiu no isolamento (hidrodestilação) dos OEs de plantas in vivo de: alfazema (espigas florais), funcho amargo e salsa (infrutescências e partes vegetativas) e aneto (partes vegetativas); e sua posterior análise em GC e GC-MS. Os dados quantitativos foram obtidos recorrendo ao GC-FID enquanto a identificação dos constituintes foi efectuada com base na análise dos espectros de massa (consulta das bases de dados) e na determinação dos KI. No conjunto das amostras, 88 a 99,5% dos constituintes foram identificados. O funcho e a alfazema permitiram uma recolha de maiores volumes de OE (3-5% e 4% v/p, respectivamente) relativamente à salsa (0,25-1,2% v/p). As flores de alfazema caracterizaram-se pelo seu elevado teor percentual em linalool (55%), cânfora (11%) e terpinen-4-ol (8%), enquanto os respectivos rebentos caulinares, cultivados in vitro (meio MS com 0,5 mg/l BA), distinguiram-se pelo seus conteúdo em 1,8-cineole (23%), cânfora (15%) e borneol (11%). As infrutescências de funcho apresentaram estragole (53%), fenchona (17%) e transanetole (14%) como principais compostos e as partes vegetativas foram caracterizados pelo seu teor em estragole (58%), α-felandreno (12%), fenchona (8%) e β-felandreno (7%). As infrutescências de salsa eram ricas em aliltetrametoxibenzeno (34%), apiole (14%), 1,3,8-p-mentatrieno (13%), α e β-pineno (13% e 12%). As folhas apresentaram teores elevados de 1,3,8-p-mentatrieno (48%) e terpinoleno mais 2,5- dimetil estireno (12%). Por fim, uma amostra de OE de caules e folhas de Aneto foi igualmente estudada. O α-felandreno (67%), o dill éter (15%) e o β-felandreno (11%) foram os compostos encontrados em maior abundância. Por seu lado, Os perfis dos OEs de plântulas de funcho, salsa e aneto germinadas e cultivadas in vitro (segunda componente do trabalho), foram substancialmente diferentes dos perfis das respectivas plantas in vivo. Elevados teores de miristicina (35%), apiole (11%) e dill apiole (10%) (fenilpropanóides) foram detectados em plântulas de aneto. Numa segunda fase, a actividade larvicida dos OEs de alfazema, funcho e salsa foi avaliada através da realização de ensaios de sensibilidade em larvas de An. atroparvus, no IHMT (Lisboa). As emulsões de OE em água foram testadas numa gama de concentrações optimizadas. O tratamento estatístico (análise Log-Probit) e a determinação dos parâmetros de letalidade (CL50 e CL90) após 24 e 48h de exposição, foi realizado com a aplicação do sofware SPSS 16.0. O OE de Alfazema foi considerado muito pouco eficiente enquanto ambos os OEs de funcho exibiram um efeito letal satisfatório. O OE de partes vegetativas mostrou-se eficiente para causar 50% de morte (CL50=50 ppm e CL50=39 ppm, para 24 e 48h, respectivamente). Por seu lado, as concentrações letais determinadas para o OE de infrutescências para induzir 90% de morte foram menores relativamente ao OE de caules e folhas (CL90=107 ppm e CL90=129 ppm às 24h, respectivamente). A actividade larvicida dos OEs de funcho deverá estar relacionada com o seu teor em trans-anetole. Porém, os resultados evidenciados para as partes vegetativas indicam que outros compostos presentes nos OEs (estragole e fenchona, etc.) poderão ser igualmente activos. Relativamente ao OE de infrutescências de salsa, este exibiu uma toxicidade aguda.The toxic and repellent activities of aromatic plant essential oils (EOs) (terpenoids and phenylpropanoids compounds) against insects have long time been recognized (Regnault-Roger, 1997).Their potential anti-insect activity is essentially due to their relative chemical simplicity and specific mode-of-action against some insect receptors (Isman and Akhtar, 2007; Shaaya and Rafaeli, 2007). Several species of the Lamiaceae and Apiaceae family are sources of potential insect toxic compounds. This work had as objectives the characterization of the EOs from different parts of in vivo plants and respective in vitro plantlets of Lavandula angustifolia (lavender), Foeniculum vulgare var. vulgare (wild fennel), Petroselinum crispum spp. neapolitanum (plain leaf parsley), Anethum graveolens (dill) and the evaluation of their anti-insect activity against the Anopheles atroparvus (Diptera, Culicidae) mosquito, one of the most important Malaria vector in Europe, especially Portugal. The first part of investigation consisted in the isolation of EOs (hydrodistillation) from in vivo lavender (flowers spikes), fennel (infrutescences and vegetative parts), parsley (infrutescences and vegetative parts) and dill (vegetative parts) and their analysis by GC and GC-MS. Quantitative data were obtained using GC-FID and identification of constituents was achieved with help of spectra libraries and determination of their KI. Among all samples, 88 to 99.5% of constituents were identified. Fennel and lavender were found to be much more productive (3-5% and 4% v/p, respectively) than parsley (0.25- 1.2% v/p) which respect to EO content. Lavender flowers were characterized by high contents of linalool (55%), camphor (11%) and terpinen-4-ol (8%) and the EO from lavender shoots cultured in vitro (MS medium and 0.5 mg/l of BA) was especially rich in 1,8-cineole (23%), camphor (15%) and borneol (11%). Fennel EO from infrutescences had estragole (53%), fenchone (17%) and trans-anethole (14%) as main compounds, while the EO from Fennel vegetative parts was mainly constituted by estragole (58%), α-phellandrene (12%), fenchone (8%) and β-phellandrene (7%). Parsley infrutescences presented allyltetramethoxybenzene (34%) as the main constituent of the EO, followed by apiole (14%), 1,3,8-pmenthatriene (13%), α- and β-pinene (13% and 12%). Leaves and stems of Parsley showed a higher content of 1,3,8-p-menthatriene (48%) and terpinolene plus 2,5- dimethylstyrene (12%). A sample of dill EO from stems and leaves was also studied. α-Phellandrene (67%), dill ether (15%) and β-phellandrene (11%) were the most abundant compounds. On the other hand, the EO profiles of fennel, parsley and dill plantlets germinated and cultivated in vitro (second phase of the work) were substantially different from the original in vivo plants profiles. Dill plantlets were extremely rich in myristicin (35%), apiole (11%) and dill-apiole (10%) (phenylpropanes). In a second part of the work, the mosquito larvicidal activities of lavender, fennel and parsley EOs were evaluated by larvicidal assays conducted against third instars larvae of the An. atroparvus mosquito in the IHMT (Lisbon). The EOs were tested as emulsions in water in a range of optimized concentrations. A statistic approach was achieved using the SPSS 16.0 software for Log-Probit analysis and determination of lethality parameters (LC50 and LC90) at 24 and 48h of time exposure. Lavender EO was considered ineffective while both EOs from wild fennel showed a satisfactory lethal effect. The EO from fennel vegetative parts showed little more effectiveness in killing 50% of larvae (LC50=50 ppm and LC50=39 ppm, at 24 and 48h). However, lethal concentrations of fennel infrutescences EO inducing 90% of mortality (LC90=107 ppm at 24h and LC90=96 ppm at 48h) were lower than the lethal concentrations determined for vegetative parts (LC90=129 ppm at 24h and LC90=110 ppm at 48h). Larvicidal activity of fennel infrutescence EO can be related with the trans- anethole content. Moreover, the results evidenced by vegetative parts indicate that other existing compounds (estragole, fenchone, etc.) could be as well active as this one. The EO from parsley infrutescences showed an acute toxicity