Study of Hypericum perforatum defense mechanisms against Colletotrichum gloeosporioides: relevance of phenolic metabolism and hypersensitive response

Tese de doutoramento em Ciências (ramo de conhecimento em Biologia)H. perforatum (HP) é uma planta medicinal encontrada em todo o mundo, sendo nativa da Europa, norte de África, Oriente Médio e grande parte da Ásia. Introduzida também noutras regiões do globo devido ao seu elevado valor terapêutico, essa planta é descrita desde tempos imemoriais para o tratamento de diversas maleitas. Actualmente, sua principal aplicação consiste no tratamento de depressões leves e moderadas sendo que, em diversos países, a prescrição de produtos à base de Hipericão é superior a dos medicamentos antidepressivos mais comuns. Devido à grande procura daí resultante, a pressão exercida junto aos produtores agrícolas tem aumentado consideravelmente. O cultivo em larga escala, como solução para o abastecimento de um mercado em crescimento, tem sofrido vários revezes. Dentre os mais relevantes encontra-se a contaminação pelo fungo Colletotrichum gloeosporioides, causador de antracnose em inúmeras espécies vegetais de elevado interesse económico. A infecção por C. gloeosporioides (CG) tem levado a perdas significativas, tanto na quantidade, como na qualidade dos produtos derivados de HP. Embora não existam variedades totalmente resistentes ao fungo, algumas apresentam menor susceptibilidade à antracnose in vivo. Considerando esses aspectos, nosso objectivo consistiu em estudar alguns dos mecanismos de defesa de H. perforatum contra C. gloeosporioides. Foram avaliadas, nomeadamente, a resposta hipersensível (HR) e o metabolismo fenólico. Adicionalmente, foi avaliada a influência de duas hormonas associadas a mecanismos de defesa sistémica: metil-jasmonato (MeJ) e ácido salicílico (SA). Todos os estudos descritos foram realizados com recurso a culturas de células em suspensão provenientes de duas variedades de HP, distintas na sua susceptibilidade ao fungo CG in vivo. Culturas de células de HPS (variedade susceptível) e Helos (menos susceptível) foram avaliadas quanto ao consumo de nutrientes, crescimento e viabilidade, tanto em condições normais de manutenção como após tratamento com os eliciadores descritos acima. O tratamento com uma preparação de CG levou a um aumento significativo no consumo de açúcar bem como a uma diminuição no crescimento e viabilidade celular. Esses efeitos foram corroborados pelos resultados obtidos nos ensaios de TUNEL, durante a avaliação da HR. Foi verificado, em ambas suspensões de HP, o desenvolvimento de um burst oxidativo duplo, típico de interacções incompatíveis. Verificou-se igualmente a acumulação de espécies reactivas de oxigénio (ROS), tanto internamente como a nível extracelular, após eliciação com CG. A eliciação foi também responsável pela redução na actividade de enzimas antioxidantes (SOD e CAT), favorecendo a acumulação de ROS. Contraditoriamente, observou-se um aumento do potencial antioxidante dos extractos metanólicos de HP, derivado do aumento na acumulação de xantonas. Esse aumento não foi, no entanto, capaz de contrariar a alteração na homeostasia das ROS, culminando assim num aumento da peroxidação lipídica e degradação do DNA, fenómenos tipicamente associados à HR. O aumento na acumulação de xantonas foi a principal alteração verificada no metabolismo fenólico, após eliciação com CG, podendo esta resposta estar associada ao aumento no consumo de açúcar, usado como fonte de carbono para a sua síntese. O aumento na produção de xantonas pode ter sido igualmente responsável pelo declínio na acumulação de flavonóides e lenhina visto que estas vias biossintéticas recorrem ao mesmo pool de precursores, canalizados para a síntese de xantonas. Ao contrário do que foi verificado com CG, o tratamento de HP com MeJ ou SA levou a pequenas ou nenhumas alterações, na maior parte dos parâmetros avaliados. Não se verificaram alterações significativas no crescimento, sobrevivência e consumo de nutrientes, excepto um ligeiro aumento no consumo de açúcar, após tratamento com MeJ. Tal como descrito para as xantonas, este aumento poderá estar associado aos acrescidos níveis de lenhina, observados no tratamento com MeJ. Ambas as fitohormonas foram responsáveis por um ligeiro aumento na produção de xantonas (e consequente redução na síntese de flavonóides). De igual modo, o uso destas fitohomonas levou a um ligeiro aumento na acumulação de ROS embora não se tenha verificado HR, provavelmente devido ao aumento da capacidade antioxidante de HP, entretanto observada. Nem sempre se verificam diferenças notórias entre as respostas associadas ao SA e ao MeJ já que as vias de defesa sistémica a que estão associadas apresentam muitos pontos de intercâmbio, com diversas variáveis intervindo nas mesmas. Embora não se tenham verificado alterações muito significativas nas respostas de HP, decorrentes da aplicação isolada das fitohormonas, o seu uso levou a um aumento nas capacidades de resposta de HP quando estas eram aplicadas previamente à exposição ao fungo (CG). Apesar de superior quantitativamente, essa resposta foi, regra geral, qualitativamente semelhante à verificada pelo tratamento isolado com CG. Verificaram-se assim uma maior redução na viabilidade e um incremento no consumo de açúcar, bem como uma maior acumulação de xantonas (notório em HPS). Sendo assim, embora não se tenham verificado efeitos visíveis significativos decorrentes do tratamento isolado de HP com as fitohormonas, as mesmas demonstraram ter alterado o metabolismo de HP de forma a preparar a planta para uma resposta mais rápida e intensa, numa posterior interacção com CG. A interacção incompatível verificada entre HP e CG culminou numa HR, bem como na síntese de xantonas, possivelmente para actuarem como fitoalexinas contra o patogénio. Ambos os mecanismos de defesa são aparentemente ineficazes no combate à infecção por CG, considerando o que se verifica in vivo. Tendo em conta que CG pode apresentar tanto um modelo de nutrição biotrófica como necrotrófica, o desenvolvimento de HR pode mesmo favorecer a natureza necrotrófica de CG, ao providenciar ao fungo locais ideais para a colonização do hospedeiro. Além da ineficácia da HR, os compostos fenólicos produzidos por HP após a eliciação não se mostraram capazes de impedir o crescimento de CG in vitro. Embora não tenham sido efectuados estudos em plantas, os mecanismos de defesa analisados neste trabalho culminaram em respostas mais intensas em culturas da variedade Helos, podendo estas diferenças explicar a sua menor susceptibilidade à antracnose in vivo.H. perforatum is a medicinal plant widely distributed across the world, being native in Europe, Northern Africa, Middle East and most of Asia. This plant was also introduced in other regions of the world due to its high therapeutic value, described since ancient times for the treatment of several ailments. Nowadays, the medicinal impact of H. perforatum is mainly focused in the treatment of mild to moderate depressions and, in some countries, Hypericum-based products are prescribed more often than the most common antidepressants. The increasing medicinal and economic relevance of this plant is responsible for a mounting pressure over rawmaterial producers. While H. perforatum plantations have been established in order to properly supply the growing market, some drawbacks in large-scale production started to appear. The most prominent is contamination by Colletotrichum gloeosporioides, a fungus responsible for the development of anthracnose disease in several economically important crops across the globe. C. gloeosporioides infection is known to reduce H. perforatum yields, as well as the quality of its derived products. Although no H. perforatum accessions have so far proven to be fully tolerant to anthracnose, some of them are known to be less-susceptible to this disease in vivo. Considering these aspects, it was our aim to study some of H. perforatum defense mechanisms against C. gloeosporioides. Namely, the hypersensitive response (HR) and phenolic metabolism were evaluated. Additionally, the influence of methyl-jasmonate and salicylic acid, two phytohormones related to plant defense signaling, was also assessed. The experiments were carried out in H. perforatum suspension cell cultures obtained from two accessions, distinct in their susceptibility to C. gloeosporioides in vivo. Cell cultures from HPS (a susceptible accession) and Helos (a less-susceptible accession) were characterized in their major nutrients consumption and survival parameters upon normal growth conditions or after treatment with the elicitors described. Treatment with a C. gloeosporioides elicitor preparation (CG) was responsible for a significant increase in sugar consumption but also a considerable decrease in cell viability and culture growth. This decrease was in accordance with the results obtained during HR evaluation by TUNEL labeling. H. perforatum cultures developed a double oxidative burst, typical of incompatible interactions. Reactive oxygen species (ROS) accumulated both internally and extracellularly after CG treatment. Enzymatic ROS-scavenging (namely, SOD and CAT) activities were suppressed, favoring ROS buildup, while a contradictory increase in non-enzymatic scavenging mechanisms was observed, due to a boost in xanthone synthesis. Still, this raise was not enough to prevent the change in ROS homeostasis, which culminated in increased lipid peroxidation, DNA cleavage and, therefore, HR. The boost in xanthone accumulation was the most prominent change in phenylpropanoid metabolism upon CG elicitation and should be associated to the enhanced consumption of sugar, a possible source of carbon for the xanthone synthesis. The increase in xanthones produced could be responsible for the decline in flavonoids and lignin accumulation since these biosynthetic pathways share a common pool of precursors, diverted to xanthone synthesis. Treatment with the phytohormones, on the other hand, led to minor or absent changes in most parameters evaluated. No survival or nutrient consumption parameters were significantly influenced by them, except for a small increase in sugar consumption, observed upon MeJ treatment. As previously referred for the accumulation of xanthones, this increase could be associated to the raise in lignin accumulation observed. Both MeJ and SA were also responsible for a minor increase in xanthone production (and concomitant decrease in flavonoids synthesis). Furthermore, these phytohormones led to a minor increase in ROS accumulation although no HR occurred, perhaps due to the enhancement in scavenging means, also observed. A clear dichotomy between the two systemic defense signaling pathways is not always possible and extensive cross-talk is known to occur, with many variables influencing it. Despite the absence of noticeable changes, when these phytohormones were used prior to CG elicitation, cells displayed a tendency for increased responses, following patterns similar to those found in CG-elicited cultures. A sharper decrease in survival parameters and enhanced sugar consumption were observed, as well as increased xanthone synthesis, especially in HPS cultures. Therefore, while the phytohormones alone didn’t provide marked effects, the cell’s metabolism could have been primed and tuned for improved defense responses as displayed later, upon CG elicitation. The incompatible interaction observed between H. perforatum and C. gloeosporioides culminated in HR as well as the synthesis of xanthones, probably acting as phytoalexins against the pathogen. Considering what is usually observed in vivo, both defense mechanisms seem to be ineffective against the fungus. Since C. gloeosporioides can display either biotrophic or necrotrophic nutrition models, HR may actually favor its necrotrophic nature by providing new entry points for infection. Additionally, the phenolic compounds induced upon elicitation were not able to stall C. gloeosporioides growth in vitro. Despite their inefficiency, these defense mechanisms were stronger in Helos cultures and could account for the reduced susceptibility of this accession, as observed in vivo. Further studies in vivo should be performed before drawing definite conclusions about this plant-pathogen interaction.Fundação para a Ciência e Tecnologia - SFRH/BD/13318/200