Adipose derived stem cells for bone and cartilage tissue engineering : novel isolation procedure in vitro characterization and in vivo functionality assessment

Tese de doutoramento em Ciência e Tecnologia de Materiais (área de conhecimento em Engenharia de Tecidos/Materiais Híbridos)Adult Stem cells are undifferentiated cells that can be found in various tissues or organs and that can renew itself and differentiate to yield some or all of the major specialized cell types and therefore have been widely studied for a variety of cellbased therapies, including tissue engineering approaches. Stem cells from the bone marrow, usually designated as Mesenchymal Stem Cells (MSCs), have been the elected cellular component, particularly in bone and cartilage tissue engineering strategies. This is mainly because they can be used in autologous approaches and because they are relatively easy to grow and to expand in vitro, presenting a great differentiation potential. Nevertheless, bone marrow harvesting is a painful procedure and the number of stem cells in the bone marrow is rather low. In recent years, many researchers have focused on alternative sources of stem cells that could overcome these limitations, such as the use of adipose tissue. In fact, the harvesting procedure to obtain adipose tissue is not painful, it is quite safe and the human body possesses several reserves of this tissue. As a consequence, since the Adipose-derived Stem Cells (ASCs) were isolated for the first time, a number of studies have been showing their high potential for application in tissue engineering, mainly because of the high number of stem cells per unit of tissue that can be obtained, the high replication rate and the great differentiation potential. Nevertheless, the knowledge on adipose stem cells is still very limited as compared with the bone marrow mesenchymal stem cells population. This thesis focused on the study of adipose derived stem cells as a potential cell source for bone and cartilage tissue engineering approaches. It was centered on the development and optimization of efficient isolation procedures and on the characterization of the in vitro and in vivo functionality of the different ASCs subpopulations meanwhile identified. The main objectives of this thesis were the following: - Development and optimization of an isolation procedure aiming at decreasing the presence of other cells types that might compromise the expansion and differentiation potential of the adipose derived stem cells. - Identify the presence of distinct subpopulations of ASCs (similarly to the findings that have been reported for the bone marrow mesenchymal stem cells) and characterize them, specifically regarding their osteogenic and chondrogenic differentiation potential. - Study the behavior of the adipose stem cells subpopulations in vitro and in vivo, in order to select those that, always combined with appropriate support materials, could be more efficient for bone and for cartilage tissue regeneration strategies. The first objective was accomplished through the development and optimization of a novel selective technique for the isolation of adipose stem cells that is based on the use of immunomagnetic beads coated with specific antibodies. Using this procedure, it was possible to isolate several subpopulations of rat and human ASCs, which were characterized towards the expression of the typical markers of stem cells and also regarding the osteogenic and chondrogenic potential. The results obtained in these studies provided evidence of the existence of a number of distinct ASCs subpopulations. Additionally, it was clearly shown that there are important differences in the behavior of the rat ASCs, as compared to human ASCs, which led to the exclusion of the rat model for subsequent studies. Further in vitro studies, focused on human ASCs, allowed selecting the subpopulations with the highest chondrogenic and osteogenic differentiation potential. In vivo studies, using a nude mice model, were designed to study the in vivo osteogenic and chondrogenic potential of these selected subpopulations, which were implanted after in vitro culture using appropriate templates for bone and cartilage TE applications, respectively. The data collected from these in vivo experiments highlighted the distinct behavior of the cells in vitro with respect to their behavior in vivo, and enabled for the further selection of the sub-populations with the highest chondrogenic or osteogenic differentiation potential. In summary, this work presents an alternative method to isolate adipose stem cells, that enables to obtain selected subpopulations with distinct characteristics, namely different osteogenic and chondrogenic differentiation potentials. The isolation method and consequently, the selected subpopulations for a given application, might allow for a more efficient use of ASCs, enhancing the potential of this cell source to become the “gold standard” in tissue engineering applications.As células estaminais adultas são células indiferenciadas presentes em vários tecidos ou órgãos com capacidade de se auto-regenerar e diferenciar em quase todos os principais tipos de células especializadas. Por esta razão, têm sido vastamente estudadas para um conjunto de terapias celulares, incluindo a engenharia de tecidos humanos. As células estaminais da medula óssea, geralmente designadas células estaminais do mesênquima (MSCs), têm sido um dos componentes celulares de eleição, particularmente em estratégias de engenharia de tecidos do osso e cartilagem. Isto deve-se sobretudo ao facto de poderem ser usadas de uma forma autóloga, mas também devido à sua fácil cultura e expansão in vitro e ao seu excelente potencial de diferenciação. No entanto, a extracção de medula óssea é um procedimento tipicamente doloroso, que muitas vezes origina um número reduzido de células estaminais. Nos últimos anos, muitos investigadores concentraram-se em encontrar fontes alternativas de células estaminais adultas que permitem ultrapassar estas limitações. O tecido adiposo é um dos exemplos de uma fonte alternativa de células com muito potencial. De facto, o processo de extracção de tecido adiposo não é doloroso, é seguro e o corpo humano possui várias reservas deste tecido. Por conseguinte, desde que as células estaminais do tecido adiposo (Adipose Stem Cells – ASCs) foram isoladas pela primeira vez, têm sido efectuados numerosos estudos que evidenciam o seu elevado potencial para aplicações em engenharia de tecidos, dada a elevada concentração de células estaminais e a sua alta taxa de replicação e elevado potencial de diferenciação. Contudo, o conhecimento sobre a população de células estaminais do tecido adiposo é ainda muito incipiente, particularmente quando comparado com o da população de células estaminais da medula óssea. Esta tese centrou-se no estudo de células estaminais do tecido adiposo como potencial fonte de células alternativa para aplicações em engenharia de tecidos de osso e cartilagem, nomedamente no desenvolvimento e optimização de métodos de isolamento eficientes e na caracterização da funcionalidade, in vitro e in vivo, das diferentes subpopulações identificadas entretanto. Dentro deste enquadramento, os principais objectivos propostos foram os seguintes: - Optimização de técnicas de isolamento visando diminuir a presença de outros tipos de células, susceptivies de comprometer o potencial de proliferação e diferenciação das células estaminais do tecido adiposo; - Identificar a presença de subpopulações em amostras de células estaminais do tecido adiposo e determinar o seu potencial osteogénico e condrogénico, à semelhança do que tem sido feito para as células estaminais da medula óssea; - Estudar diferenças no comportamento destas subpopulações de células in vitro e in vivo, de forma a selecionar as subpopulações que, combinadas com materiais de suporte adequados, possam ser mais apropriadas para aplicações especificas em engenharia de tecidos do osso ou cartilagem. O primeiro objectivo foi concretizado através do desenvolvimento e optimização de uma técnica inovadora para o isolamento selectivo de células estaminais do tecido adiposo, assim como de subpopulações destas. Esta técnica é baseado no uso de partículas imuno-magnéticas revestidas por anticorpos específicos. Usando este procedimento, foi possível isolar várias subpopulações de ASCs humanas e de rato, posteriormente caracterizadas quanto à expressão de marcadores típicos das células estaminais, bem como do seu potencial osteogénico e condrogénico. Estes estudos evidenciaram a existência de diferenças significativas entre os modelos humano e de rato. Os resultados obtidos in vitro permitiram seleccionar as subpopulações com maior potencial de diferenciação osteogénico e condrogénico. Os estudos in vivo foram baseados num modelo de rato atímico para avaliar o potencial osteogénico e condrogénico das subpopulações seleccionadas, as quais foram implantadas após um período de cultura in vitro em suportes apropriados para engenharia de tecidos de osso ou de cartilagem, respectivamente. Os resultados obtidos nas experiências in vivo permitiram evidenciar diferenças significativas entre o comportamento in vitro e in vivo e também permitiram realizar uma selecção adicional das subpopulações com o melhor potencial de diferenciação osteogenico e condrogenico. Resumindo, este trabalho descreve um método de isolamento alternativo de células estaminais do tecido adiposo, que permite obter várias subpopulações com características distintas, nomeadamente com potenciais de diferenciação. Este método de isolamento e consequentemente a possibilidade de selecionar subpopulações especificas para uma dada aplicação, pode permitir uma utilização mais eficiente das células estaminais do tecido adiposo, contribuindo para o seu uso mais alargado em Engenharia de Tecidos