Fluorescence study of Sol-Gel derived protein silica hybrids for optical biosensor

Tese de doutoramento em Ciências (área de conhecimento em Física)The encapsulation of enzymes for optically addressed biosensor applications is an area of great importance. Firstly there is a need to provide a robust, optical quality host in which to incorporate the biomolecule. In principle the host matrix should be “inert” (with minimum interaction with the guest enzyme), protective and should retain the enzyme within its structure, allowing maximum catalytic activity and free passage of the reactants both to and from the enzyme. Materials which are promising in this respect are silica glasses made via the sol-gel technique. They are optically transparent, have a high porosity and they template around the biomolecule providing a protective host. However, the encapsulation process can have adverse effects; the loss of enzymatic catalytic activity can happen and the mass transport through the host is not ideal! In this work fluorescence techniques were used to monitor the incorporation of an enzyme into a sol-gel derived medium. Several additives were used in tuning the original sol-gel recipe to improve biocompatibility. Complementary measurements of catalytic activity were performed to elucidate the behaviour of the encapsulated protein. Molecular diffusion was monitored using labelled proteins and unbound fluorescence dye molecules (representative of enzyme substrates) and their interaction with and mobility within the host assessed using time-resolved fluorescence anisotropy and fluorescence recovery after photobleaching observed via confocal microscopy. Viscosity (DASPMI) and polarity (Nile red) sensitive fluorescence probes were employed to monitor the host matrices. Nile red was also used to label two catalytic proteins (cytochrome c and subtilisin Carlsberg), which were incorporated into different host media and the dye used to ascertain changes in protein conformation. Overall it was found that the hosts became stable after an aging period approaching twenty days and that the major influence on the catalytic reaction rates is that of host mediated mass transport.A utilização de enzimas para a construção de biosensores ópticos tem evidenciado um notável desenvolvimento. Neste contexto, a tecnologia sol-gel, cuja versatilidade é a palavra-chave do seu sucesso, tem demonstrado enormes potencialidades. A oclusão de enzimas em matrizes de sílica pela técnica sol-gel permite a obtenção de híbridos com boas qualidades ópticas e considerável robustez física. Para além disso, a sua porosidade permite a difusão dos substratos enzimáticos e produtos de reacção, com retenção da enzima constituindo, simultaneamente, um meio protector contra agentes físicos, químicos e biológicos. Contudo, o processo tem as suas fragilidades, nomeadamente a perda de actividade catalítica devido a desnaturação da enzima, e constrangimentos relativamente ao livre-trânsito dos analitos. Neste trabalho, foram utilizadas técnicas de fluorescência para seguir a incorporação de proteínas em matrizes de sílica pela técnica sol-gel. A receita original foi adaptada, utilizando-se aditivos (silanos ou polímeros) para melhorar a biocompatibilidade dos híbridos. A difusão molecular foi estudada usando proteínas marcadas com sondas fluorescentes e fluoróforos livres, através das técnicas de anisotropia de fluorescência resolvida no tempo e recuperação de fluorescência após fotobranqueamento, esta última utilizando a microscopia confocal. A polaridade e a viscosidade das matrizes foram estudadas utilizando as sondas Nile red e DASPMI, através da medição de fluorescência no estado estacionário (fazendo uso da técnica de varrimento síncrono de fluorescência), ou resolvida no tempo. A sonda Nile red, por ser hidrofóbica e solvatocrómica, foi escolhida para marcação das proteínas e levar a cabo estudos de conformação enzimática. Estudos complementares de actividade catalítica, foram realizados para caracterizar o comportamento do biocatalisador encapsulado. Concluiu-se que as matrizes produzidas utilizando o nosso método, estabilizam ao fim de um período de aproximadamente 20 dias e que a taxa de transformação substratoproduto das proteínas estudadas, é mais influenciada pelas restrições impostas pela matriz ao livre-trânsito dos analitos, do que pela desnaturação das biomoléculas.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Bolsa de Doutoramento SFRH / BD / 27933 / 200