Cellulases for detergent applications

Tese de Doutoramento em Engenharia Têxtil (Área de Conhecimento de Química Têxtil)Cellulases are known to add detergency process in cellulosic garments, by removing entrapped soils in microfibrilar material. Other properties of fabrics, as softening or color brightness, can be also enhanced by the presence of these enzymes. They have a modular structure consisting of a catalytic domain, which is usually linked to a cellulose-binding module (CBM). The CBM is responsible for the binding of the enzyme to cellulose and dictates the mobility and efficiency of the enzyme on the cellulose surface. Cellulases which would be contained on actual laundry detergent formulations were evaluated on cotton fabrics. The impact of these cellulases to hydrolyse cotton fibres was studied in order to define general parameters for cellulases applications in detergents. The consideration of other cellulases as appropriate for detergency purposes was evaluated on the basis of those parameters. Different methodologies were introduced in order to monitor the formation of the products resulting from enzymatic hydrolysis. The first one is based on the reaction of the compound 3,5-Dinitrosalicylic acid (DNS) with the reducing sugar groups released to the bath treatment and the other one is based on the reaction of the compound neocuproine with the terminal reducing end groups at the surface of the treated fabrics. In this work, HiCel45, ThCel45, HiCel5 and BaCel5 cellulases were used to treat cellulosic substrates in order to evaluate the effect of different glycosidic families from different sources. By comparing the impact of cellulase on carboxymethyl cellulose (CMC), filter paper and cotton fabrics, it became clear that two of these cellulases have the most differentiated effects on the tested substrates. HiCel45 acts efficiently on insoluble substrates containing both crystalline and amorphous regions. By contrast, BaCel5 produced significant amounts of reducing sugars towards amorphous soluble cellulose substrates, while low efficiency on insoluble cellulose was observed. In order to study the interactions of each cellulase towards cotton fabric, HiCel45 and BaCel5 were investigated more accurately. The present investigation required to discover general information about the present enzymes, since certain information about them was not entirely disclosed. The HiCel45 belongs to the hydrolytic family number 45 and has a CBM classified as an A CBM from family 1 having a wedge-like structure. On the other hand, BaCel5 contains a CBM consisting in a tandem about one family 17 CBM and one family 28. CBM17 and CBM28 are classified as B CBMs, which are supposed to be highly selective regarding amorphous cellulose achieving single glucan-binding properties. The binding affinities were different for each cellulase: BaCel5 could not be dissociated from cellulose by buffer dilution and did not show a measurable exchange rate, binding irreversibly to cellulose. However, HiCel45 was found to bind reversibly to cellulose because it showed low adsorptions. The impact of the irreversible binding of BaCel5 on cotton fabrics after several treatments was also analyzed. Changes on the morphology, accessibility of cotton fabric and disruption of fibre structure were studied, however no detectable hydrolytic activity was found. In addition, the possible influence effect of different mechanical agitation action was evaluated for both enzymes towards cotton fabrics. According to the reducing sugar and the Scanning Electron Microscopy (SEM) analysis, both cellulases exhibited clear effect of the mechanical action. The findings suggested that mechanical agitation influences greatly the efficiency of HiCel45 to hydrolyze the cotton fabric surface, since significant amounts of reducing sugar were found in treatment solutions. The results from BaCel5 showed that mechanical agitation increases the enzymatic action until a certain level, whether the enzymatic action is measured as release of reducing sugar or reducing ends production on the cotton fabric surface. It was also shown that the fabric damage using vertical mechanical agitation could be minimized by using short treatment times and low cellulase concentration. This fact can be enhanced for washing process in laundry detergents, being both cellulases suitable candidates to be applied on these washing systems. On the basis of the knowledge obtained from the evaluation of the mechanical agitation action, new experimental conditions were tested. Using High Performance Liquid Chromatography (HPLC) for the detection of the hydrolysis degradation products, it was found that both cellulases differ on the efficiency and the type of soluble sugar release from cotton fibres. Although HiCel45 can degrade cotton cellulose into large amounts of cellobiose and cellotriose, BaCel5 produces low concentrations of glucose and cellobiose. The impact of Ca2+ ions on the effect of the studied cellulases was also evaluated since detergent performance is highly dependent on the hardness composition of water for each region. The results confirmed that BaCel5 does not show significant differences in the presence of Ca2+ ions, neither in the hydrolysis efficiency nor in the fibre properties. However, HiCel45 was able to hydrolyse the cotton giving cellopentose as new degradation product by using Ca2+ in the medium, whereas no significant differences were found on the fabric characterization. These results exhibited that HiCel45 could degrade cotton fibres in a different way by controlling water hardness conditions. The results obtained also demonstrated that a careful balance between enzyme activity and mechanical action is required to achieve efficient pill removal without excessive fabric damages. Thus, the variation of reducing end groups could give valuable information about the relative activities of different types of cellulases at different conditions. The knowledge attained would allow the introduction of new enzymes by comparing with the proposed mechanism of action. Therefore, test other enzymes on the optimized conditions is proposed as a future task, either different types of cellulases or engineered fusion proteins enhanced for these purposes.No processamento de vestuário constituído por fibras celulósicas, as celulases são conhecidas pelas suas propriedades de detergência, removendo partículas (nódoas) do material microfibrilar. Para além disso a presença destas enzimas melhora outras propriedades dos tecidos como o toque e a cor. As celulases têm uma estrutura modular que consiste num domínio catalítico, geralmente ligado a um módulo de ligação à celulose (cellulose-binding module (CBM). O CBM é responsável pela ligação da enzima à celulose, pela sua mobilidade e pela eficiência da enzima ao longo da superfície da celulose. As celulases actualmente presentes em formulações de detergentes para roupa foram testadas em tecidos de algodão. O impacto destas celulases na hidrólise das fibras de algodão foi estudado com o objectivo de definir parâmetros genéricos para a aplicação das mesmas. Foram ainda estudadas outras celulases com vista à sua incorporação em detergentes. Com base naqueles parâmetros, diferentes metodologias foram testadas para monitorizar a formação de produtos resultantes da hidrólise enzimática. A primeira é baseada na reacção do ácido 3,5-dinitrosalicílico com açúcares redutores que são libertados para o banho de tratamento. A outra metodologia é baseada na reacção da neocuproína (2,9-Dimetil-1,10- fenantrolina hemihidratada) com os grupos redutores terminais da superfície do tecido tratado. Neste trabalho foram utilizadas as celulases HiCel45, ThCel45, HiCel5 e BaCel5 no tratamento de substratos celulósicos com o objectivo de avaliar o efeito de diferentes famílias glicosídicas com diferentes origens. Comparando o impacto das celulases em carboximetil celulosa (CMC), papel de filtro e tecidos de algodão tornou-se evidente que duas destas celuloses apresentam efeitos mais diferenciados nos substratos testados. A HiCel45 actua eficazmente em substratos insolúveis contendo simultaneamente regiões cristalinas e amorfas. Por outro lado a BaCel5 produz quantidades significativas de açúcares redutores face a substratos celulósicos amorfos solúveis, apresentando uma eficiência muito baixa perante celulose insolúvel. Nos estudos mais aprofundados das interacções de cada celulase face a tecidos de algodão apenas foram utilizadas as enzimas HiCel45 e BaCel5. Foi necessário caracterizar as enzimas utilizadas dada a pouca informação disponível acerca das mesmas. A enzima HiCel45 pertence à família hidrolítica número 45, contendo um CBM classificado como CBM A da família 1. Por seu lado a BaCel5 contem um CBM com características das famílias 17 e 28. Ambas as famílias CBM17 e CBM28 são classificadas como CBM's B, normalmente mais selectivas para celulose amorfa, tendo propriedades únicas para a ligação a glucanos. As afinidades de ligação são diferentes para cada celulase: a BaCel5 não pode ser dissociada da celulose através da diluição por adição de tampão, não sendo possível observar uma velocidade de permuta mensurável, ligando-se irreversivelmente à celulose. No entanto a HiCel45 liga-se reversivelmente à celulose uma vez que apresentou baixa adsorção. O impacto da ligação irreversível da BaCel5 nos tecidos de algodão depois de vários tratamentos não foi analisado. Foram estudadas alterações na morfologia e acessibilidade nos tecidos de algodão e na ruptura da estrutura das fibras. No entanto não foi detectada actividade hidrolítica. Para cada uma das enzimas foi ainda estudado o efeito da agitação mecânica nos tecidos de algodão. De acordo com as análises aos açúcares redutores e de Microscopia de Varrimento Electrónico a agitação mecânica influencia a actividade de cada uma das celulases. Os resultados sugerem que a agitação mecânica influencia fortemente a capacidade da HiCel45 hidrolisar a superfície dos tecidos de algodão, uma vez que foram encontradas quantidades significativas de açúcares redutores no meio das soluções de tratamento. Os resultados para a BaCel5 mostram um efeito sinergistico entre a agitação mecânica e a actividade enzimática até atingir um máximo, quer a actividade enzimática seja mediada através da libertação de açúcares redutores, quer seja medida através da produção de terminações redutores na superfície do tecido. Foi também provado que os danos no tecido provocados pela utilização de agitação vertical podem ser minimizados pela utilização de tempos de tratamento curtos e com baixa concentração de celulase. Estes factores podem ser optimizados com vista à sua utilização em processo de lavagem de roupa, sendo ambas as celulases potenciais candidatas à aplicação em detergentes. Tendo como base o conhecimento adquirido no estudo do efeito da agitação mecânica, foram executados outros testes abrangendo diferentes condições experimentais. Utilizando o método de HPLC para a detecção dos produtos de degradação hidrolítica, descobriu-se que as enzimas apresentam diferentes comportamentos no que diz respeito à eficiência e à qualidade dos açúcares redutores libertados do tecido. Enquanto que a HiCel45 degrada a celulose do algodão produzindo quantidades elevadas de celobiose e celotriose, a BaCel5 produz baixas concentrações de glucose e celobiose. O impacto dos iões Ca2+ no comportamento das celulases foi também avaliado, uma vez que a eficácia de um determinado detergente é altamente dependente da dureza da água de cada região. Os resultados mostram que a actividade da BaCel5 não sofre efeito significativo com a presença dos iões cálcio, tanto no que diz respeito à eficiência da hidrólise como no que diz respeito às propriedades da fibra. No caso da HiCel45, verificou-se o aparecimento de celopentose como um novo produto de hidrólise quando esta ocorre na presença de Ca2+, não tendo sido detectadas diferenças significativas na caracterização dos tecidos depois do tratamento. Estes resultados sugerem que a HiCel45 pode degradar as fibras de algodão de diversas formas, podendo ser controlado pela dureza da água. Os resultados obtidos mostram que é necessário um equilíbrio entre a actividade enzimática e a acção mecânica sem provocar danos excessivos no tecido. Assim, a variação dos grupos terminais redutores pode dar informações sobre as actividades relativas dos diferentes tipos de celulases em diferentes condições. O conhecimento obtido neste trabalho acerca do mecanismo de actuação das enzimas poderá permitir a introdução de outras em processos de detergência. A sua aplicação nas condições optmizadas mostra-se um caminho a seguir tanto para celulasas como para proteínas de fusão.Marie Curie Actions (EU) funding by means of an EST grant (MEST-CT-2005-019885 Marie Curie Actions)The research described in this thesis was performed at the Departamento Têxtil da Universidade do Minho (Guimarães, Portugal) and at Procter&Gamble research centres (BIC-Brussels, NTC-NewCastle). This work was financially supported by Marie Curie Actions (EU) funding by means of an EST grant (MEST-CT-2005-019885 Marie Curie Actions).The research described in this thesis was performed at the Departamento Têxtil da Universidade do Minho (Guimarães, Portugal) and at Procter&Gamble research centres (BIC-Brussels, NTC-NewCastle). This work was financially supported by Marie Curie Actions (EU) funding by means of an EST grant (MEST-CT-2005-019885 Marie Curie Actions)