Use of bacteriophages to control biofilms

Tese de doutoramento em Engenharia Química e BiológicaAfter several years of abandonment, the use of bacteriophages (phages) for killing bacteria has withdrawn recent attention and reappraisal. This has led to a vast phage research, in varied fields, with impressive outcomes and currently several studies are ongoing with animals, horticulture and agriculture products, and even with humans. Despite this enthusiasm, there is a lack of research conserning phage utilization to reduce bacteria living on surfaces in a lifeform known as biofilms. This work explores the potential of phages in controlling bacteria present in single and dual species biofilms. Gram-negative Pseudomonas fluorescens and Gram-positive Staphylococcus lentus, widespread inhabitants of dairy plant surfaces and products were the studied bacterial hosts. P. fluorescens is the dominant microorganism present in the microflora of raw or pasteurized milk at the time of spoilage and commonly isolated from contaminated fresh meats and refrigerated products. S. lentus is coagulase-negative staphylococci (CoNS) and a member of the S. sciuri group. CoNS are the bacteria most frequently recovered from infected bovine and caprine mammary glands. Before performing biofilm studies, special emphasis was given to isolation of new lytic phages and to their thorough characterization. Several phages were isolated amongst which φIBB-PF7A and φIBB-SL58B were selected for the control experiments. Both belong to the Podoviridae family and can kill a wide host range. Phage φIBB-PF7A resembles, morphologically, physico-chemically and genomically, to T7-like phages while φIBB-SL58B cannot, so far, be assigned to any known Podoviridae group and is possibly a novel type of phage. After the characterization of the phage candidates, their ability to infect biofilms was investigated. P. fluorescens biofilms exhibited cells with two distinct morphologies that, independently of the age of the biofilm infected, were efficiently killed by phage φIBBPF7A. Unexpectedly, the best infection by S. lentus phage φIBB-SL58B was found to be the killing of their hosts formed under severe starvation conditions. Furthermore, biofilms of S. lentus colonized better the substratum than P. fluorescens cells, and in effect S. lentus was the predominant bacterium in most dual species biofilms investigated. The dual species biofilms were challenged using two approaches. A phage cocktail, for each of the hosts of the dual species biofilms, decreased efficiently not only the cell number in the biofilm, but also the cells which were released to the planktonic phase. The use of a single phage, for the less predominant bacterium, revealed that the applied phage (φIBBPF7A) can efficiently reach the host and reduce their cell number in the biofilm, but also may cause the release of the non-susceptible species to the planktonic phase. Interestingly and contrarily to what is commonly described in literature, one of the studied phages (φIBB-PF7A) proved to be excellent in killing stationary phase host cells. The conditions under which the phages are applied are important factors to be considered. Rotary agitation and medium conditions (exchange or non-exchange) influenced vastly phage killing of biofilm cells. Additionaly, rotary agitation, temperature, host cell length and growth rate influenced planktonic cell lysis by phage (φIBB-PF7A). Nevertheless, the optimal conditions for phage infection are highly depended on the phage-host system investigated, as demonstrated in φIBB-PF7A and φIBB-SL58B infection experiments performed with their respective hosts.Após vários anos de abandono, assistiu-se, recentemente, ao crescente interesse científico e reconhecimento das notáveis capacidades dos bacteriófagos (fagos) no controlo de bactérias. São diversos os domínios de aplicação de fagos como agentes de controlo de bactérias, nomeadamente na produção animal, horticultura e agricultura e existem inclusive investigações a decorrer com humanos. Apesar deste recente entusiasmo, há uma grande lacuna relativamente à utilização de fagos para a redução de bactérias aderidas a superfícies ou mais propriamente biofilmes. Este trabalho explora a utilização de fagos no controlo de bactérias presentes em biofilmes formados por uma única espécie bacteriana ou mistos (constituidos por várias espécies). As bactérias Gram-negativa Pseudomonas fluorescens e Gram-positiva Staphylococcus lentus são ubíquas em superfícies e produtos da indústria dos lacticínios. P. fluorescens é a bactéria dominante da microflora dos leites, não-pasteurizados e pasteurizados, estragados e frequentemente isolada de carnes e produtos refrigerados estragados. S. lentus, é uma bactéria coagulase-negativa (CoNS), pertence ao grupo de S. sciuri e pode causar doenças em animais. As CoNS são, de facto, as bactérias mais frequentemente isoladas de bovinos e caprinos com infecção das glândulas mamárias. Antes de serem iniciados os estudos de infecção de biofilmes, procedeu-se deu-se ao isolamento de novos fagos e à sua rigorosa caracterização. Foram isolados vários fagos para P. fluorescens e S. lentus e do conjunto total de fagos purificados, os fagos φIBBPF7A e φIBB-SL58B, foram seleccionados para os estudos de controlo de biofilmes. Ambos pertencem à familia Podoviridae e têm um espectro lítico alargado. O fago φIBBPF7A assemelha-se morfologicamente e genomicamente a fagos do tipo T7, enquanto que o fago φIBB-SL58B poderá ser um novo tipo de fago uma vez não há semelhanças morfológicas, genómicas nem fisico-quimicas com nenhum fago descrito na literatura. O fago φIBB-PF7A foi capaz de lisar com grande eficiência os biofilmes de P. fluorescens, independentemente da idade do biofilme. Inesperadamente, este estudo revelou que a melhor infecção dos biofilmes de S. lentus por perte do fago φIBB-SL58B foi conseguida em biofilmes formados sem renovação do meio de crescimento. No que respeita à infecção de biofilmes mistos, formados por P. fluorescens e S. lentus, utilizouse duas estratégias distintas: o uso de um cocktail formado pelos dois fagos e a aplicação de apenas um fago específico para a bactéria minoritariamente presente nos biofilmes mistos, a P. fluorescens. A primeira estratégia revelou uma redução no número de células viáveis presentes nos biofilmes e de células libertadas dos biofilmes para a fase planctónica. A utilização de apenas um fago foi eficaz no controlo das células de P.fluorescens presentes no biofilme, assistindo-se a uma destruição parcial do biofilme e consequentemente à libertação para a fase planctónica da bactéria não susceptível ao fago. Contrariamente ao que é frequentemente descrito na literatura, um dos fagos estudados (φIBB-PF7A) revelou uma elevada eficácia na lise de células na fase estacionária de crescimento. A avaliação de diferentes condições de ifecção é fundamental de forma a se conseguir optimizar a eficiência fágica no controlo de biofilmes e células planctónicas. Este trabalho evidencia que a aplicação de fagos no controlo dos hospedeiros é influenciada por factores tais como: a velocidade de agitação, temperatura e vários parâmetros relacionados com o hospedeiro tais como o seu tamanho, taxa específica de crescimento e com as condições usadas na formação de biofilmes nomeadamente a renovação ou não de meio de crescimento. No entanto, este trabalho revela também que as condições óptimas de infecção fágica dependem bastante do fago e hospedeiro investigados como verificado em ensaios de infecção realizados com os fagos φIBB-PF7A e φIBB-SL58B e os seus respectivos hospedeiros.Portuguese Foundation for Science and Technology through the grant SFRH/BD/18485/200