Fisiologia de leveduras em processos de fermentação alcoólica

Tese de Doutoramento em Engenharia Química e BiológicaThis thesis is focused on physiological aspects of the yeasts used in two alcoholic fermentation processes: primary brewing fermentation and fermentation of lactose (particularly lactose derived from cheese whey) to ethanol by recombinant Saccharomyces cerevisiae flocculent strains. The brewing fermentation is probably the most extensively studied alcoholic fermentation process. Nevertheless, developments in brewing technology demand deeper understanding of yeast physiology under process conditions. The studies with brewer’s yeast reported in this thesis addressed two specific questions that had not yet been effectively investigated. First, it is here directly demonstrated for the first time that the brewer’s yeast lipid composition, particularly the amounts of sterols and unsaturated fatty acids, affects the activity of maltose transporters. The maltose uptake rates were correlated with the amount of ergosterol in yeast, showing that proper function of the maltose permeases requires adequate amounts of ergosterol in the plasma membrane. This effect may partly explain the low maltose (and maltotriose) transport rates at the beginning and during the second half of brewery fermentations, when the sterol content of the yeast is low. Second, the energetic state of the yeast was studied under the specific environments of high- and very high-gravity brewing fermentations. The adenylate energy charge (EC) of the yeast was high (>0.8) throughout fermentation until residual sugar concentrations became low and specific rates of ethanol production became less than 5% of the maximum values observed in early fermentation. At that point, the EC fell to around 0.5 – 0.6. The results suggest that the ethanol tolerance of brewer’s yeast is high so long as fermentation continues. However, when residual α-glucoside concentrations no longer support adequate rates of fermentation both the EC and the yeast viability collapse. The development of microorganisms that efficiently ferment lactose has a high biotechnological value for the design of processes for the bioremediation of cheese whey with simultaneous production of bio-ethanol. A new lactose-fermenting flocculent S. cerevisiae recombinant strain is described here. This strain (T1-E) was obtained by evolutionary engineering of an original recombinant (T1, constructed in previous work) that had shown rather poor lactose fermentation and flocculation performances. The new strain T1-E consumed lactose 2-fold faster producing 30% more ethanol than T1. Its flocculation performance was also significantly better than that of T1. A series of physiological and genetic studies were done to compare T1 and T1-E. The contribution of the identified molecular differences to the improved lactose fermentation phenotype of strain T1-E is discussed. In batch fermentations with mineral medium, the new strain T1-E consumed rapidly and completely lactose at initial concentrations up to 150 g•L-1. The maximum ethanol titre reached was 8% (v/v) and the highest ethanol productivity was 1.5 – 2 g•L-1•h-1. T1-E was also able to ferment 3-fold concentrated cheese whey (about 150 g•L-1 of lactose), producing 7% (v/v) of ethanol. These results demonstrate that T1-E is the most efficient lactosefermenting S. cerevisiae recombinant strain reported in the literature. Being highly flocculent, this strain is suitable for developing high cell density fermentation systems that, when operated in continuous with flocculated biomass retention, can reach very high productivities. Sugar transport is a key factor determining fermentation efficiency in both processes studied in this thesis. Studies of lactose transport by the recombinant S. cerevisiae strains (T1 and T1-E) and by Kluyveromyces lactis revealed that zero-trans uptake rates of lactose measured by standard methodology (i.e. using suspensions of yeast harvested from fermentation, washed and stored in nutrient-free buffer at low temperature before they are assayed using radiolabeled sugar) were too small (by factors of 3 to 8) to account for the lactose consumption rates observed during fermentations. A short incubation (1 – 7 min) with glucose (10 – 30 mM) increased the low intracellular ATP and EC of cells in the starved yeast suspensions to the levels found in actively fermenting yeast cells, and simultaneously increased the activity (Vmax) of the lactose transporters by factors of 1.5 to 5. Similar observations were made for maltose transport in brewer’s yeasts. These results suggest that the electrochemical proton potential that drives transport through sugar/H+ symports is significantly smaller in the starved yeast suspensions used for the zero-trans assays than in actively metabolising cells. Short exposure of the starved cells to glucose is suggested as a quick method to approach more closely the sugar/H+ symport capacity of the actively fermenting cells.Esta tese foca-se em aspectos relacionados com a fisiologia de leveduras utilizadas em dois processos de fermentação alcoólica: a fermentação primária da cerveja e a fermentação de lactose (em particular a lactose derivada do soro do queijo) para produção de etanol por estirpes floculantes de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificadas. A fermentação da cerveja é provavelmente o processo de fermentação alcoólica mais extensivamente estudado. Todavia, o desenvolvimento da tecnologia para o fabrico de cerveja requer uma compreensão mais aprofundada da fisiologia da levedura nas condições específicas deste processo. Os estudos com levedura de cerveja descritos nesta tese abordaram duas questões específicas que não haviam ainda sido efectivamente investigadas. Em primeiro lugar, é aqui demonstrado pela primeira vez que a composição lipídica da levedura de cerveja, em particular o seu conteúdo em esteróis e ácidos gordos insaturados, afecta a actividade dos transportadores de maltose. Verificou-se uma relação entre as taxas de transporte de maltose e a quantidade de ergosterol na levedura, demonstrando que o funcionamento adequado das permeases da maltose requer quantidades adequadas de ergosterol na membrana plasmática. Este efeito poderá explicar parcialmente as baixas taxas de transporte de maltose (e maltotriose) no início e durante a segunda metade das fermentações de cerveja, fases em que o conteúdo de esteróis da levedura é baixo. Em segundo lugar, o estado energético da levedura foi estudado nas condições específicas de fermentações de cerveja com mostos de alta e muito alta gravidade. A carga energética (EC) da levedura foi elevada (>0.8) durante a fermentação até a concentração residual de açúcar se tornar baixa e as taxas específicas de produção de etanol baixarem para menos de 5% dos valores máximos observados na fase inicial da fermentação. Nesse ponto, a EC decaiu para cerca de 0.5 – 0.6. Os resultados sugerem que a tolerência da levedura de cerveja ao etanol é elevada enquanto a fermentação prosseguir. No entanto, quando as concentrações residuais de α-glucosídeos não mais sustentam taxas de fermentação adequadas tanto a EC como a viabilidade da levedura colapsam. O desenvolvimento de microrganismos que fermentem de forma eficiente a lactose tem um elevado valor em termos biotecnológicos para o desenho de processos para a biorremediação do soro do queijo com produção de bio-etanol em simultâneo. Uma nova estirpe recombinante de S. cerevisiae capaz de fermentar a lactose e floculante é descrita nesta tese. Esta estirpe (T1-E) foi obtida por evolução dirigida a partir de uma estirpe recombinante original (T1, construída em trabalho prévio) que havia demonstrado um fraco desempenho em termos de fermentação de lactose e de floculação. A nova estirpe, T1-E, foi capaz de consumir a lactose duas vezes mais rapidamente e de produzir 30% mais etanol do que a estirpe T1. Foram efectuados vários estudos fisiológicos e genéticos para comparar as estirpes T1 e T1-E. A contribuição das diferenças identificadas ao nível molecular para o fenótipo melhorado da estirpe T1-E em termos de fermentação de lactose é aqui discutida. Em fermentações descontínuas com meio mineral, a nova estirpe T1-E consumiu rapidamente e por completo lactose em concentrações iniciais até 150 g•L-1. A concentração máxima de etanol atingida foi 8% (v/v) e a produtividade máxima foi 1.5 – 2 g•L-1•h-1. A estirpe T1-E foi também capaz de fermentar soro do queijo três vezes concentrado (cerca de 150 g•L-1 de lactose), produzindo 7% (v/v) de etanol. Estes resultados demonstram que a estirpe T1-E é a estirpe recombinante de S. cerevisiae mais eficiente para fermentação de lactose descrita na literatura. Sendo floculante, esta estirpe é adequada para desenvolver sistemas de fermentação de alta densidade celular que, quando operados em continuo com retenção da biomassa floculada, permitem atingir produtividades muito elevadas. O transporte de açúcares é um factor chave na determinação da eficiência de fermentação em ambos os processos estudados nesta tese. Estudos do transporte de lactose nas estirpes recombinantes de S. cerevisiae (T1 e T1-E) e em Kluyveromyces lactis revelaram que as taxas iniciais de transporte de lactose medidas pela metodologia padrão (i.e. usando suspensões de leveduras colhidas da fermentação, lavadas e guardadas em tampão sem nutrientes a baixa temperatura antes de serem utilizadas para ensaios com açúcar marcado radioactivamente) eram demasiado baixas (por factores de 3 a 8) para explicar as taxas de consumo de lactose observadas durante as fermentações. Uma breve incubação (1 – 7 min) com glucose (10 – 30 mM) aumentou a baixa EC e os baixos níveis de ATP intracelulares encontrados nas suspensões de leveduras guardadas sem nutrientes para os níveis encontrados em células de leveduras a fermentar activamente. Simultaneamente, essa incubação aumentou a actividade (Vmax) dos transportadores de lactose por factores de 1.5 a 5. Foram feitas observações semelhantes para o transporte de maltose em leveduras de cerveja. Estes resultados sugerem que o potencial electroquímico de protões responsável pelo transporte por mecanismos de simporte açúcar-protão é significativamente mais reduzido nas células guardadas em tampão sem nutrientes, utilizadas para os ensaios de transporte, do que nas células a fermentar activamente. Um breve tratamento das células guardadas sem nutrientes com glucose é sugerido como um método rápido para abordar de forma mais aproximada a capacidade dos sistemas de simporte açúcar-protão das leveduras a fermentar activamente.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - SFRH/BD/13463/2003