Processing and surface modification of novel natural-origin architectures aimed for biomedical applications

Tese de Doutoramento em Ciências e Tecnologia de Materiais - Área de Conhecimento em BiomateriaisIn the last decades, tissue engineering has emerged as a potential therapeutical tool aimed at developing substitutes that are able to restore proper function of the damaged organs/tissues. Nature‐inspired routes involving natural origin polymer‐based systems represent an attractive alternative to produce novel materials by mimicking the tissue environment required for tissue regeneration. Moreover, further modifications of these systems allow the adjustment of their properties in accordance with the requirements for successful biomedical applications. The main goal of the present thesis is to develop and modify natural origin polymer‐based systems using simple methodologies such as sol‐gel, surface modification by means of plasma treatment and blending of chitosan with proteins (soy protein isolate and silk fibroin). A sol‐gel method was used to improve the bulk properties of chitosan by the incorporation of an inorganic component at the sub‐nanometric level. Chitosan/siloxane hybrid materials were synthesised, where essentially urea bridges covalently bond the chitosan to the polysiloxane network. These bifunctional materials exhibit interesting photoluminescence features and a bioactive behaviour. In most situations in the biomedical field, the surface of a biomaterial is in direct contact with living tissues. Therefore, the surface characteristics play a fundamental role on the implant biocompatibility. In this thesis, nitrogen and argon plasma treatment was applied on chitosan membranes in order to improve their surface properties. The applied modifications promoted differences on surface chemistry, wettability and roughness, which reflected in a significant improvement of fibroblast adhesion and proliferation onto chitosan membranes. Besides the surface modification, blending of chitosan with proteins such as soy protein isolate and silk fibroin was also used to modify the bulk properties of chitosan. In situ cross‐linking with glutaraldehyde solutions was used to enhance the interaction between the components of the blend. Hence, membranes with different morphologies, water absorption and degradability were obtained. The biological assays suggested that the cross‐linking with lower glutaraldehyde concentration promotes better cell adhesion on the membranes. The morphological characterization showed that both surface roughness surface and surface energy were dependent on soy protein content. Structural investigations by FTIR and NMR indicated that the blends are not completely miscible due to a weak polysaccharide‐protein interaction. In another related work, novel hydrogels were produced combining Bombyx mori silk fibroin and chitosan. In this case, these systems were cross‐linked with genipin. These hydrogels were freeze dried to obtain cross‐linked chitosan/silk sponges. Rheological and mechanical properties, structural aspects and morphological features of the porous structures were evaluated. The results revealed stable and ordered structures, similar porosities, and swelling capability that depended on the pH. The cytotoxicity assay indicated that cellular viability was about 100% in all sponges and for all time points studied (1, 3, 7 and 14 days), demonstrating the extremely low cytotoxicity levels of the materials. Cell studies using chondrocytes‐like cells seeded onto sponges, including cell viability (MTS assay), proliferation (DNA test), morphology (SEM analysis) and matrix production (GAGs quantification), showed a significant high adhesion, proliferation and matrix production with the time of culture. The findings in this work suggested that the properties of the sponges can be manipulated by either change chitosan/silk fibroin ratio or through genipin cross‐linking. Parallel to this study, the possibility of obtaining modified silk nanometric nets using electrospinning processing from regenerated silk fibroin/formic acid with addition of genipin was explored. Modified silk nanofibers with diameters ranging from 140 nm to 590 nm were developed. The changes on the secondary structure of nanofibers, induced by the reaction of silk fibroin with genipin, promoted a higher integrity of these modified nanofibers in water. In summary, the findings from these works demonstrated the potential and versatility of the proposed strategies in obtaining different structures (e.g. membranes, hydrogels) using mixtures of chitosan with proteins or with inorganic agents for improving the performance of natural origin polymer‐based materials to be used in biomedical applications.Nas últimas décadas, a engenharia de tecidos emergiu como uma solução terapêutica alternativa dentro das estratégias possíveis relacionadas com a reparação e regeneração de órgãos/tecidos danificados, no sentido de restabelecer a sua capacidade funcional. As estratégias envolvendo sistemas à base de biopolímeros representam uma alternativa promissora para a produção de novos materiais para a regeneração de tecidos. Materiais de origem natural e, consequentemente, de fontes renováveis, surgem como uma escolha interessante para recriar o ambiente envolvente do tecido afectado. No entanto, modificações químicas nos biomateriais poderão ser necessárias para melhorar as suas propriedades, ajustando‐as a determinadas aplicações biomédicas. O principal objectivo da presente tese consistiu no desenvolvimento e modificação de sistemas à base de polímeros de origem natural usando metodologias como o “solgel”, a modificação superficial através do tratamento por plasma e combinações de quitosano com proteínas da soja e da fibroína da seda. De modo a modificar as propriedades internas do quitosano, uma parte inorgânica foi incorporada ao sistema macromolecular através do método “sol‐gel”. Como resultado, materiais híbridos de quitosano/siloxano foram sintetizados, onde se estabeleceram ligações covalentes entre o quitosano e a rede inorgânica. Estes materiais bifuncionais demonstraram características interessantes de fotoluminescência e um comportamento bioactivo. É frequente a superfície de um biomaterial estar em contacto directo com os tecidos vivos. Assim sendo, as características da sua superfície têm um papel fundamental na biocompatibilidade do implante. Com o objectivo de melhorar as propriedades de superfície de membranas de quitosano, estas foram tratadas por plasma utilizando azoto e árgon, resultando em diferenças na química de superfície, molhabilidade e na rugosidade das membranas. Estas modificações estimularam a adesão e proliferação celulares de fibroblastos quando cultivados nas membranas de quitosano. Além das modificações de superfície, as propriedades internas do quitosano foram modificadas através da adição da proteína da soja e da fibroína da seda. Foram usadas reacções de reticulação in situ, com soluções de glutaraldeído em sistemas à base de quitosano com soja, de modo a aumentar a interacção entre os componentes do sistema. As membranas reticuladas apresentaram morfologias, absorção de água e degradabilidade diferentes. As membranas reticuladas com uma baixa concentração de glutaraldeído apresentaram melhor adesão celular quando comparadas às restantes membranas. Através da caracterização morfológica demonstrou‐se que tanto a rugosidade de superfície como a energia de superfície estava directamente relacionada com o conteúdo da proteína de soja usada no sistema. Estudos estruturais utilizando as técnicas de FTIR e RMN indicaram que as misturas não são completamente miscíveis devido às fracas interacções entre polímero e proteína. Novos hidrogéis foram também produzidos combinando a fibroina da seda e o quitosano reticulados com “genipin”. Em seguida, os hidrogéis foram liofilizados para obter esponjas de quitosano/seda. Os resultados relativos às propriedades reológicas e mecânicas assim como os aspectos estruturais e as características morfológicas, revelaram estruturas estáveis e ordenadas, porosidades similares e capacidade de inchamento dependentes do pH. A análise de citoxicidade indicou uma viabilidade celular de aproximadamente 100% em todas as esponjas produzidas e em todos os tempos de cultura estudados (1, 3, 7 e 14 dias), evidenciando os níveis extremamente baixos de citoxicidade dos materiais. Estudos de cultura celular utilizando uma linha celular de condrócitos cultivados nas esponjas, nomeadamente viabilidade (teste MTS), proliferação (teste do ADN) e morfologia (análise do SEM) celulares bem como a produção de matriz extracelular (quantificação dos GAGs), mostrou melhoramento a todos os níveis ao longo dos tempos de cultura. Os resultados deste trabalho sugeriram que as propriedades das esponjas podem ser controladas, quer pela composição de quitosano e de fibroina da seda, quer pela reticulação com o “genipin”. Paralelamente a este estudo, foi explorada a possibilidade de se obterem fibras nanométricas de proteína de seda modificadas usando o processo de “electrospinning” a partir de soluções de fibroina da seda regenerada dissolvida em ácido fórmico com adição de genipin como agente de reticulação. Deste modo, nanofibras de seda modificadas foram desenvolvidas com diâmetro entre 140 nm e 590 nm. As mudanças na estrutura secundária das nanofibras, induzidas pela reacção de fibroina da seda com “genipin”, promoveram uma maior integridade das nanofibras em água. Os resultados obtidos a partir destes trabalhos experimentais demonstraram o potencial e versatilidade das estratégias e materiais propostos para a obtenção de diferentes estruturas (por exemplo, membranas, hidrogéis) utilizando soluções à base de quitosano, e suas combinações com proteínas ou mesmo com agentes inorgânicos para melhorar o desempenho de materiais à base de polímeros naturais em aplicações biomédicas