Effects of Salvia officinalis in the liver : relevance of glutathione levels

Tese de Doutoramento em Ciências BiológicasSalvia officinalis L (Lamiaceae, salva comum) é uma planta aromática que cresce espontaneamente em Portugal, bastante conhecida pelas suas propriedades medicinais. Duas das principais propriedades medicinais atribuídas a esta planta são como antioxidante e antidiabética. No entanto, ainda não existem suficientes evidências experimentais que demonstrem estes efeitos e em particular os mecanismos inerentes em sistemas biológicos. No presente trabalho, os estudos dos efeitos antioxidantes e antidiabéticos foram realizados no I fígado e em hepatócitos. Uma vez que os compostos da salva passam primeiro pelo fígado após a absorção gastrointestinal, estes podem atingir concentrações consideráveis neste órgão possibilitando a indução de efeitos biológicos. Além disso, o fígado tem uma grande capacidade de biotransformação, é bastante susceptível a efeitos tóxicos de xenobióticos e é também afectado por bastantes doenças onde se reconhece o envolvimento de stresse oxidativo. Deste modo, para além dos prováveis benefícios do consumo de salva para o fígado, estes estudos permitiram-nos observar possíveis efeitos tóxicos desta planta e interacções com outros compostos. Três tipos de extractos foram estudados: o óleo essencial (OE), um extracto metanólico e a extracto aquoso de salva preparado sob a forma de um chá. Numa primeira série de experiências (capítulo 2), usando ensaios com suspensões de hepatócitos de rato, observou-se que o OE de salva não teve efeitos antioxidantes. Pelo contrário, a altas concentrações (maiores que 2 ~1/ml), o óleo de salva induziu significativamente morte nas células, a qual foi acompanhada por uma depleção nos níveis de GSH (forma reduzida da glutationa) mas não por uma indução da peroxidação lipídica. A diminuição dos níveis de GSH foi provavelmente um dos mecanismos responsáveis pelos efeitos tóxicos do OE. Em seguida, após uma experiência in vivo com ratinhos onde se verificou que o chá de salva melhorava a resposta antioxidante do fígado (capítulo 3), no c.apítulo 4 foram estudados os efeitos directos de salva em células HepG2 (linha celular de hepatoma humano). A salva protegeu contra a morte celular induzida pelo tert-butil hidroperóxido - um modelo de stresse oxidativo - revelando o seu potencial antioxidante directo em células. A sua acção nos níveis de GSH foi muito importante, prevenindo significativamente a sua depleção. O efeito citoprotector dos extractos da salva foi dependente da composição dos extractos ym compostos fenólicos bem como da sua actividade antiradicalar. Também no capítulo 4, verificou-se que os mesmos extractos eram capazes de elevar os níveis basais de GSH em células HepG2, indicando uma capacidade em melhorar as defesas antioxidantes. o aumento de GSH poderá ter acontecido através da indução da síntese de novo da glutationa, o que é também corroborado por uma experiência anterior com hepatócitos de rato em cultura (capítulo 3). Nessa experiência, o chá de salva dado in vivo fez recuperar os níveis de GSH dos hepatócitos, após o isolamento com colagenase, para valores mais altos do que na situação controlo. Adicionalmente, o chá de salva induziu significativamente as actividades das enzimas GST (capítulo 3), GPox e NADPH citocromo P450 redutase bem como, em alguma extensão, algumas enzimas citocromo P450 em fígado de ratinho (capítulo 5). Estes efeitos antioxidantes indirectos parecem deixar o fígado mais bem preparado para combater uma situação de stresse oxidativo e o efeito tóxico de xenobióticos. No entanto, contrariamente ao que era esperado, o tratamento prévio com chá de salva não protegeu a hepatotoxicidade induzida pelo tetracloreto de carbono (CC4) em ratinhos (capítulo 5). Em vez disso, ocorreu uma potenciação da toxicidade do CC4. Esta interacção pode ser explicada, pelo menos em parte, pelo aumento significativo induzido pelo chá da proteína CYP 2EI. Estes resultados chamam a atenção para possíveis interacções entre a salva e fármacos ou outros xenobióticos metabolizados pelo fígado. No entanto, isso provavelmente não acontecerá, a menos que uma elevada quantidade de salva for consumi da por um longo período de tempo. Em relação aos estudos das actividades antidiabéticas da salva, descritos no capítulo 6, verificou-se que o chá desta planta reduziu a glucose plasmática em jejum em ratinhos, indicando efeitos ao nível da gluconeogénese. Isto foi confirmado com experiências utilizando hepatócitos em cultura isolados de ratos, nos quais o chá de salva reduziu a indução da gluconeogénese pelo glucagon. Além disso, verificou-se que o chá de salva aumentou o consumo de glucose pelas células e que o OE aumentou a sensibilidade. das células à insulina e inibiu a gluconeogénese. No geral, estes efeitos assemelham-se aos obtidos com o fármaco metformina, usado no tratamento e prevenção da diabetes. No entanto, em hepatócitos isolados de ratos diabéticos induzidos pela estreptozotocina, estes efeitos não foram observados. Os resultados sugerem contudo, que a salva poderá ser utilizada na prevenção da diabetes tipo 2, principalmente em pessoas em risco de a desenvolver. Em conclusão, os resultados aqui apresentados confirmam os efeitos antioxidantes e hipoglicémicos de salva em sistemas biológicos, embora o seu uso terapêutico contra doenças do fígado e a diabetes necessite de mais investigação. No entanto, neste momento a salva pode ser encarada como um suplemento alimentar que poderá ter efeitos benéficos na prevenção, a baixo custo, da diabetes tipo 2 e de doenças do fígado. Para além disso, a prevenção de outro tipo de doenças também poderá ser considerada, principalmente aquelas onde é conhecido o envolvimento de stresse oxidativo, tal como o cancro e doenças neurodegenerativas. Por último, toma-se relevante relembrar que o consumo de salva, por períodos prolongados de tempo, em conjunto com certos fármacos poderá levar a efeitos indesejados devido a interacções planta-fármaco.Salvia officinalis L. (Lamiaceae, common sage) is an aromatic plant that grows in Portugal well known for its medical properties. Antioxidant and antidiabetic effects are among the medicinal properties attributed to this plant. However, both still lack of biological experimental confrnnation. Since sage compounds, after gastrointestinal absorption, first pass through the liver, givingan opportunity to accumulate to considerable concentrations, the antioxidant and antidiabetic studies reported here focused on the liver. In addition, the liver is a biotransforming organ, susceptible to toxic effects of xenobiotics and affected by several tiver ., diseases where oxidative stress is known to be involved. Therefore, these studies allowed us to observe, besides the benefits of sage consumption to the tiver, the possible toxic effects of sage and interactions with other drugs. Three different extracts of sage were studied: the essential oi! (EO), a methanolic extract and a water extract (prepared as a tea). In chapter 2, sage EO was tested in freshly isolated rat hepatocytes. No direct antioxidant effects were observed in tiver cells. On the contrary, at higher concentrations (more than 2 ~l/ml), sage EO induced significant cell death, which was accompanied by GSH. (glutathione - reduced form) depletion but not by tipid peroxidation. The GSH depletion induced by sage EO was probably an important mechanism that explains EO toxic effects. Then, after an in vivo experiment with mice, where sage tea drinking (for 14 days) improved the tiver antioxidant status (chapter 3), the direct effects of sage were studied on HepG2 cells (a human hepatoma cell tine) in chapter 4. Sage extracts protected against cell death induced by tert-butyl hydroperoxide - a model of oxidative stress - revealing their direct antioxidant effects at cellular leveI. Sage was able to act at a cell critical parameter, the GSH levels, preventing GSH depletion. The cytoprotective effect of sage was found to be dependent on its composition in phenotic compounds and their antiradical activity. AIso in chapter 4, not only did sage extracts prevent GSH depletion in a situation of oxidative stress, they also increased basal GSH levels in HepG2 cells. This fact indicated a capacity of sage extracts to improve basal cell antioxidant defences. The increase in basal GSH levels may possibly have happened by induction of de novo glutathione synthesis, which was corroborated by a different set of experiments using rat hepatocytes in culture (chapter 3). In that study, sage tea given in vivo restored hepatocyte GSH levels after collagenase isolation to higher levels when compared with controls. Sage tea was, in addi~ion, able to induce significantly the activities of GST (chapter 3), GPox and NADPH cytochrome P450 reductase and also, slightly, some CYP enzymes (chapter 5) in mice liver. These indirect antioxidant effects may leave liver cells better prepared to face oxidative stress and toxicants. However, contrarily to what was expected, sage tea drinking did not protect carbon tetrachloride (CCI4)-induced hepatotoxicity in mice (chapter 5). lnstead, sage tea potentiated the , toxicity of CCl4 in mice liver of both genders. This herb-toxicant interaction may be explained, at least in part, by the significant induction of CYP 2El protein by sage tea. Since the dose of sage tea used in this study was much higher than what is usually taken by humans, sage tea-drug interactions are not likely to happen in humans. Nevertheless, these results draw attention to possible herb-drug interactions between sage and drugs metabolised by the liver. Regarding the antidiabetic effects (chapter 6), sage tea was found to lower fasting plasma glucose in mice indicating effects on gluconeogenesis. This was confmned in the experiments using normal rat hepatocytes in culture, where sage tea drinking induced a decrease in gluconeogenesis in response to glucagon. ln addition, sage tea drinking increased glucose uptake capacity and, sage EO further increased hepatocyte sensitivity to insulin and inhibited gluconeogenesis. Overall, these effects resemble those obtained with the pharmaceutical drug metformin used in the treatment and prevention oftype 2 diabetes mellitus. ln primary cultures of hepatocytes isolated from streptozotocin-induced diabetic rats none of these activities, however, was observed. Nevertheless, the metformin-like effect observed here suggests a possible type 2 diabetes preventive potential of sage tea, mainly in people at risk of developing it. ln conclusion, the antioxidant effects of sage, at cellular and liver levels, were demonstrated by these results as well as its hypoglycaemic effects. ln order to apply sage products as a therapeutical tool for diabetes and liver diseases more research has, however, to be done. Nevertheless, sage products may now be considered as a functional food or a food supplements that could have a beneficial impact in low cost prevention strategies of diabetes and liver diseases. ln addition, the treatment and/or the prevention of other kind of diseases where oxidative stress is known to be involved, such as cancer and neurodegenerative diseases, may also benefit from the regular consumption of sage. Care should be taken, however, not to use high doses of sage products, over extended periods of time, in combination with conventional pharmaceutical drugs, since undesired herb-drugs interaction may take place.Ministério da Ciência e do Ensino Superior - Programa Operacional Ciência, Tecnologia e Inovação, Programa Operacional Ciência e Inovação 2010Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - POCTI/AGR/43482/2001, POCI/AGR/62040/2004Fundo Social Europe