Mecanismos de resistência associados à vacinação pelo BCG: implicações para o desenho de novas estratégias preventivas contra infecções por micobactérias

Tese de Doutoramento Ciências da Saúde – Ciências Biológicas e BiomédicasWorldwide, Mycobacterium tuberculosis infections are responsible for approximately 2 million deaths each year and the control of tuberculosis remains one of the most important challenges in the fight against infectious disease. The struggle against this mycobacterial infection has been performed using the vaccine M. bovis Bacille Calmette-Guérin (BCG) and the administration of anti-mycobacterial drugs. However it is clear that vaccination has to be improved for the following reasons: i) the efficacy of BCG vaccination is not satisfactory, ranging from 0-80%, ii) there has been an increase of mycobacterial strains resistant to the most common drugs actually used. The development of new vaccines requires however that significant effort be put into the study of the host-parasite interactions in this infection. It is with this in mind that I have investigated the cellular response to the vaccine BCG. It is known that interferon (IFN)-γ, associated with the development of acquired immune responses mediated by T helper (Th)1 lymphocytes, plays an essential role in the control of infection by mycobacteria. IFN-γ-gene-deficient ( ifn2-/-) mice are highly susceptible to mycobacterial infection and exhibit enhanced accumulation of activated effector T cells and neutrophils within granulomatous lesions. Nevertheless these T cells are not associated with control of bacterial growth and are associated with the development of pathology. Recently a new phenotype of T lymphocytes (Th17), which is associated with the development of inflammatory type of responses and pathology, has been described. Th17 cells produce mainly interleukin (IL)- 17, IL-6 and tumour necrosis factor (TNF). IL-17 can act on macrophages inducing the expression of TNF, granulocyte macrophage colony stimulatin factor (GM-CSF) and IL-8, resulting in the maturation and recruitment of neutrophils. The dynamics and regulation of these cells following infection by bacteria are poorly understood. I have therefore examined the kinetics of Th1 and Th17 cellular response following infection by BCG. My data show that in C57BL/6 mice infected with BCG, both IFN-γ and IL-17-producing T cells develop early after infection, however only IFN-γ-producing T cells expand as infection progresses. In contrast, in ifn2-/- mice infected with BCG the number of IL-17-producing T cells increases dramatically. These observations point to a regulatory role of IFN-γ on the differentiation of Th17 cells. To elucidate the mechanism underlying this observation, CD4 T cells from OT II transgenic mice were cultured in the presence of bone marrow derived dendritic cells (BMDC) infected with BCG and the cognate antigen. I observed that in these conditions a significant number of Th17 cells differentiate and that the differentiation of these cells can be inhibited by the presence of IFN-γ. Furthermore IFN-γ, by increasing the production of IL-12 and decreasing the synthesis of IL-23 (a cytokine important for the differentiation of Th17 cells), modulates the differentiation of Th1 and Th17 cells. These data reinforce the necessity to perform further studies to understand the dynamics of Th1/Th17 cells following infection by mycobacteria as well as the regulatory role of IFN-γ. Although IL-17 is induced soon after mycobacterial infection, the effect of IL-17 on the bactericidal activity of macrophages was not known. To address this question bone marrow derived macrophages (BMDM) were infected with M. tuberculosis or M. bovis BCG, and treated with IFN-γ, IL-17 or both. I have shown that IL-17 increases the susceptibility of macrophages to the intracellular infection with mycobacteria and that it inhibits the macrophage bactericidal activity induced by IFN-γ. This effect of IL-17 is not dependent on the macrophage effector mechanisms related with nitric oxide production or phagosome maturation. Surprisingly, IL-17 alone but not in the presence of IFN-γ, increases macrophage survival which is related to an increased expression of IL-6, a cytokine known to induce cell survival. These data illustrate the potential for IL-17 to have an impact on disease progression and support the necessity to elucidate the role of IL-17 on mycobacterially-infected macrophages. The differentiation and persistence of Th17 cells has been considered responsible for several pathologies, including those associated with autoimmune and chronic infectious diseases. This is of interest as a well-known phenomenon of mycobacterial infection is the Koch reaction. This reaction occurs in mycobacterially-infected hosts re-exposed to mycobacterial antigens and is characterized by a massive influx of neutrophils and damaging pathologic consequences. As a result of the low level of protection afforded by BCG vaccination, and because protection is not long-lived, it has been proposed that re-vaccination should be considered. In view of the potential for Koch reaction in response to re-vaccination it is therefore essential that we have a better understanding of the molecular mechanisms leading to the Koch reaction; specifically whether Th17 cells play a role. To address this question, C57BL/6 mice were infected with M. tuberculosis. Fifteen days after infection mice were vaccinated sub-cutaneously once, twice or three-times with BCG, with an interval of fifteen days between each vaccination. Importantly I determined that the number of Th17 cells increases with the number of M. bovis BCG revaccinations. Since the presence of Th17 cells has been associated with the induction of cytokines and chemokines responsible for the differentiation and recruitment of neutrophils, I postulate that neutrophils are responsible for the pathology and tissue damage associated to the Koch reaction. In summary, my work has identified potential new mechanisms into the complex network of immune responses, occurring in response to infection and vaccination with mycobacteria. Specifically, I have demonstrated a role for IFN-γ in the regulation of Th17 cells differentiation, and the relevance of IL-23 in the sustained differentiation of Th17 cells. I have also shown that IL- 17 inhibits the bactericidal activity of infected macrophages. This has the potential to be important and of biological relevance but the role of this molecule in bacterial control must be clarified. Finally, my data support a role for IL-17 in the pathology associated to the Koch reaction and this is important for the understanding of this unique reaction. Altogether my results point to the fact that the dynamics and effector function of Th17 cells have to be taken into consideration for a better understanding of the mechanisms leading to resistance and/or pathology following infection by M. tuberculosis, as well as for the design of new vaccines.As infecções por Mycobacterium tuberculosis constituem um grave problema de saúde pública a nível mundial, sendo responsáveis por cerca de 2 milhões de mortes por ano. O controlo da infecção por M. tuberculosis tem vindo a ser feito pelo recurso à vacinação com M. bovis Bacilo Calmette-Guérin (BCG) e pela administração de fármacos anti-micobacterianos. Contudo é cada vez mais evidente que o desenvolvimento de novas vacinas é fundamental tendo em consideração: i) que a eficácia da vacinação por BCG é muito variável, com um grau de protecção que varia entre 0-80%, dependendo de factores genéticos das populações e também de factores ambientais, ii) que se tem assistido nas últimas décadas a um aparecimento cada vez mais acentuado de estirpes de M. tuberculosis multi-resistentes aos fármacos disponíveis. Neste contexto, um conhecimento mais profundo das interacções parasita-hospedeiro é necessário para que se possam desenvolver estratégias preventivas e terapêuticas mais eficazes. Tendo por base este conhecimento, fui estudar a resposta celular à vacinação por BCG. A produção de interferão (IFN)-γ, associada ao desenvolvimento de respostas imunes adquiridas do tipo de linfócitos T de ajuda (Th)1, desempenha um papel fundamental no controlo das infecções por micobactérias, pelo seu papel na potenciação dos mecanismos efectores dos macrófagos e na formação de granulomas. A formação de granulomas também ocorre em ratinhos deficientes em IFN-γ infectados por micobactérias. No entanto, estas estruturas exibem uma acumulação de neutrófilos e células T efectoras. Apesar da presença destas células no local da infecção, não se verifica o controlo do crescimento bacteriano, observando-se o desenvolvimento de patologia. Recentemente, foi descrito um novo fenótipo de linfócitos T designado por Th17. Estas células produzem essencialmente interleucina (IL)-17, IL-6 e factor de necrose tumoral (TNF) e estão associadas ao desenvolvimento de respostas inflamatórias. A acção da IL-17 sobre os macrófagos induz a expressão de TNF, factor estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) e IL-8. Contudo, a dinâmica, regulação e função efectora destas células após uma infecção por micobactérias não são conhecidas. Neste sentido, decidimos estudar a dinâmica das células Th1 e Th17 após uma infecção por BCG. Os resultados mostram que a infecção de ratinhos selvagens por BCG induz a diferenciação de células T produtoras de IFN-γ e de células T produtoras de IL-17. No entanto, apenas o número de células T produtoras de IFN-γ expande durante o curso da infecção. Pelo contrário, a infecção por BCG em ratinhos deficientes em IFN-γ resulta numa expansão do número das células T produtoras de IL-17. Esta observação sugere que o IFN-γ regula negativamente a diferenciação de células Th17. Para elucidar o mecanismo por detrás desta observação, células T CD4+ de ratinhos transgénicos (OT II) foram cultivadas com células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) infectadas com BCG e antigénio. Nestas condições, observou-se a diferenciação de um elevado número de células Th17, sendo esta diferenciação inibida pela presença de IFN- γ. Observou-se, ainda, que o IFN-γ, aumentando a produção de IL-12 e inibindo a produção da IL-23 (uma citocina importante para a diferenciação de células Th17), modela a diferenciação de células Th1 e Th17. Os meus resultados mostram, pela primeira vez, que a IL-17 pode estar envolvida na patologia associada a infecções por micobactérias e que as células Th17 são reguladas pelo IFN-γ. Estes resultados realçam a importância de estudar a dinâmica das células Th1/Th17, assim como o papel regulador do IFN-γ. No decurso das infecções experimentais por micobactérias a IL-17 é induzida numa fase precoce, no entanto, o seu papel na actividade bactericida dos macrófagos não é conhecido. Para avaliar o efeito da IL-17 na actividade dos fagócitos, macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) foram infectados com M. tuberculosis ou M. bovis BCG e tratados com IFN-γ ou IL-17. Os resultados mostram que a IL-17 aumenta a susceptibilidade dos macrófagos a infecções por micobactérias e que, adicionalmente, inibe a acção bactericida induzida pelo IFN-γ. Observei ainda que estes efeitos não são dependentes da produção de óxido nítrico nem da maturação do fagosoma, dois mecanismos efectores do macrófago descritos como intervindo no controlo das infecções por micobactérias. Verificou-se, ainda, que a IL-17 aumentava a sobrevivência in vitro dos macrófagos infectados. Dada a capacidade da IL-17 induzir nos macrófagos um aumento da expressão de IL-6, uma citoquina conhecida pelo seu efeito na sobrevivência de várias populações de células, podemos especular que o aumento da sobrevida dos macrófagos induzido pela IL-17 estará relacionado com o aumento da expressão de IL-6. Estudos adicionais serão necessários para elucidar o papel da IL-17 na progressão da infecção por micobactérias em macrófagos. A diferenciação e persistência de células Th17 estão associadas à patologia observada em algumas doenças auto-imunes e infecções crónicas. A exposição a antigénios micobacterianos em hospedeiros previamente infectados por M. tuberculosis resulta no desenvolvimento de uma patologia severa associada a um influxo massivo de neutrófilos, fenómeno designado por reacção de Koch. Como a protecção conferida pela vacinação por BCG é variável e tem, segundo alguns autores, uma duração de apenas 10 a 20 anos, tem-se vindo a sugerir que a re-vacinação pelo BCG seria uma estratégia para o controlo da tuberculose. Neste sentido, é necessário um conhecimento mais profundo dos mecanismos moleculares e celulares associados ao desenvolvimento da reacção de Koch. Para elucidar esta questão, ratinhos selvagens foram infectados com M. tuberculosis. Quinze dias depois, foram vacinados uma, duas ou três vezes com M. bovis BCG, com um intervalo de quinze dias entre cada vacinação. Os meus resultados mostram que o número de células Th17 aumentava com o aumento do número de revacinações. Uma vez que a presença de células Th17 está relacionada com o recrutamento massivo de neutrófilos, é de esperar que estes possam ser responsáveis pela patologia associada ao desenvolvimento da reacção de Koch. Em resumo, este trabalho introduz novos mecanismos na já complexa rede do desenvolvimento e regulação de respostas imunológicas, nomeadamente a regulação das células Th17 pelo IFN-γ, e a relevância da IL-23 na diferenciação das células Th17. Mostrei ainda que a IL-17, actuando nos macrófagos, inibe a sua actividade bactericida. Contudo, a relevância biológica desta observação tem que ser clarificada. Os meus resultados sugerem adicionalmente que a IL-17, associada a um recrutamento massivo de neutrófilos, poderá ser responsável pelo desenvolvimento da patologia associada à reacção de Koch. Os resultados apresentados nesta tese abrem novas perspectivas sobre a importância do estudo da dinâmica e função das células Th17 nas infecções por micobactérias, nomeadamente nos mecanismos envolvidos na resistência e desenvolvimento de patologia, tendo implicações para o desenvolvimento de novas estratégias preventivas.Fundação para a Ciência e Tecnologia - SFRH/BD/9624/2002; POCTI 2010