Novel oscillatory flow reactors for biotechnological applications

Tese de Doutoramento em Engenharia Química e BiológicaThis thesis explores the biotechnological applications of two novel scale-down oscillatory flow reactors (OFRs). A micro-bioreactor (working mostly in batch) and a continuous meso-reactor systems were developed based on a 4.4 mm internal diameter tube with smooth periodic constrictions (SPC), both operating under oscillatory flow mixing (OFM). The first part is dedicated to the flow characterisation in the novel SPC geometry. Flow patterns within SPC geometry were experimentally studied using Particle Image Velocimetry (PIV) technique at different combinations of fluid oscillation frequency (x0) and amplitude centre-to-peak (x0), and afterwards used for validation of numerical simulations via Computational Fluid Dynamics (CFDs). CFD simulations were run with 2-D axisymmetric and 3-D laminar models as wells as using a turbulent Large Eddy Simulation (LES) model using Fluent (New York, USA) software. Mixing times of the micro-bioreactor were determined for batch operation at f and x0 of 0 to 20 Hz and 0-3 mm, respectively, and correlated using a newly defined mixing coefficient (km). The control of fluid dispersion in the novel SPC geometry was studied for continuous operation of both the micro-bioreactor and the meso-reactor at different combinations of f, x0 and fluid net flow rates (v). Macroscopic flow patterns were studied through the residence time distribution (RTD) and the non-ideal tracer response was modelled by four single-phase flow models, allowing the prediction of conversion ( X ) in the novel SPC tube geometry. Further RTD experiments were performed in the presence of a steady, continuous flow rate (at various values of v) and their results were compared with those obtained from CFDs simulations. Flow patterns within this novel SPC geometry were found to be very dependent of both x0 and f. In particular, km, RTD and X have demonstrated to be manipulated by the OFM conditions, as a result of a controlled fluid convection and dispersion within the SPC tube through vortex rings detachment. It is possible to drive the macroscopic flow patterns within both the micro-bioreactor and the meso-reactor towards the ideal flow cases of plug flow reactor (PFR) or completely back-mixed reactor (or a continuous stirred tank reactor, CSTR), being the convection maximized in relation to fluid dispersion mainly at smooth OFM conditions (i.e. x0 ≤ 1 mm and f ≤ 10 Hz). A 2-D axisymmetric laminar model was found to match the flow patterns at small values of f and x0 (where flow has demonstrated to match the PFR) while a 3-D laminar model was required to simulate non-axisymmetric flow patterns (as those found in a CSTR). The 3-D laminar model was highly grid-dependent, but numerical simulations with LES were found to overcome such grid dependency. Amongst the four single-phase models used in the modelling of macroscopic flow patterns by means of the analysis of RTD results, the tanks-in-series model with backflow is highly recommended due to the physical analogy with the SPC geometry (several interconnected stages – the cavities) and for considering the existence of a backflow rate, G, between the cavities. The second part of this work is focused on exploring both the micro-bioreactor and the meso-reactor in three main biotechnological applications: i) aerobic and anaerobic growth of Saccharomyces cerevisiae in the micro-bioreactor; ii) biotechnological production/screening of γ-decalactone in the micro-bioreactor; iii) dilution refolding of lysozyme for batch (micro-bioreactor) and continuous (meso-reactor) operation. Beforehand, mass transfer within the micro-bioreactor was studied by assessing the oxygen mass transfer rates in a gas-liquid system. The effect of f and x0 on the oxygen mass transfer coefficient (kLa) and on the gas hold-up (ε) were studied at a fixed gas flow rate vgas of 0.28 mL/min. An empirical correlation was developed for kLa and related with the flow patterns observed by PIV and numerically simulated with CFDs. Gas-liquid mass transfer in the micro-bioreactor was shown to be enhanced in relation to other scale-down systems, as values of kLa up to 0.05 s-1 were obtained through OFM (f = 0 - 20 Hz and x0 = 0 - 3 mm) at a small value of vgas = 0.28 mL/min. Such improved oxygen mass transfer was suggested to be responsible for an 83 % improvement of yield of biomass growth on glucose (YX/S), obtained in the aerobic growth of S. cerivisiae in comparison with the value of YX/S obtained for a stirred tank reactor (STR). Also the 50 % reduction of the time needed for maximum γ-decalactone production with the strictly aerobic yeast Yarrowia lipolytica suggested improved mass transfer rates in the four-phase system as result of an improved contact between the different phases. It has been shown that the reciprocating nature of OFM (backflow) enhances the interaction between fluid elements. This lead to the conclusion that both the microbioreactor and the meso-reactor present design limitations for lysozyme dilution refolding, mainly when applied to continuous refolding (with the meso-reactor). In fact, an intensive protein aggregation was observed, leading to the suggestion that the meso-reactor could be used as a scale-down system for production of bio-aggregates and nano-particles. In summary, the two novel scale-down platforms are ready to contribute to accelerate the bioprocess design, by allowing the running of highthroughput screening experiments at reproduced and well- ontrolled conditions.Este trabalho explora as aplicações biotecnológicas de dois novos reactores de fluxo oscilatório (RFO) de pequena-escala: um micro-reactor e um meso-reactor contínuo, compostos por um tubo (diâmetro interno = 4.4 mm) com constrições suaves na parede (CSP), sujeitos a mistura por fluxo oscilatório (MFO). A primeira parte visa a caracterização do fluxo na nova geometria CSP. Analisaram-se os padrões de fluxo recorrendo à Velocimetria por Imagem de Partícula (VIP), para diversos valores de frequência (f) e amplitude centro-ao-pico (x0) de oscilação, os quais foram posteriormente utilizados na validação de simulações numéricas por Dinâmica de Fluidos Computacional (DFC). As simulações foram realizadas com o software Fluent (Nova Iorque, EUA), com base em modelos do tipo 2-D com simetria axial, 3-D laminar e 3-D com Simulação directa de Grandes Vórtices (SGV). Determinaram-se tempos de mistura para um funcionamento do micro-bioreactor por partidas, a diversas combinações de f e x0 (0 - 20 Hz e 0 – 3 mm, respectivamente), tendo-se encontrado uma correlação empírica para os tempos de mistura com base num novo parâmetro: o coeficiente de mistura (km). O controlo da dispersão nos dois novos reactores foi analisado para várias combinações de f, x0 e caudais de líquido (v), tendo-se analisado os padrões de fluxo macroscópicos através da distribuição dos tempos de residência (DTR). A resposta não-ideal do traçador foi modelada por quatro modelos hidrodinâmicos e permitiu prever a conversão ( X ) na nova geometria SCP. Realizaram-se experiências complementares para a situação de um caudal contínuo e estacionário (a diversos valores de v), tendo-se comparado os resultados com os previstos pelas simulações por DFC. Concluiu-se que os padrões de fluxo na nova geometria SCP são bastante dependentes quer de f quer de x0. Os parâmetros km, kLa, ε, RTD e X são manipulados pelas condições de MFO graças a um controlo efectivo sobre a convecção e dispersão do fluído no interior da geometria CSP por geração de anéis de vórtices. Em concreto, os padrões de fluxo macroscópicos no interior do microbioreactor e do meso-reactor podem ser aproximados aos casos ideais de um reactor de fluxo pistão (RFP) ou de reactor perfeitamente agitado (RPA), sendo que a convecção é maximizada (relativamente à dispersão do fluido) essencialmente a baixos valores de MFO (p. ex., x0 ≤ 1 mm e f ≤ 10 Hz). O modelo 2-D laminar com simetria axial é capaz de prever os padrões de fluxo a baixos valores de f e x0 (p. ex., RFP), mas um modelo 3-D laminar é indispensável para prever a assimetria axial do fluxo (situação de um RPA). As simulações numéricas efectuadas com o modelo 3-D laminar apresentaram-se bastante dependentes do espaçamento da grelha, enquanto que o modelo 3-D com SGV permitiu ultrapassar tal dependência. Entre os quatro modelos hidrodinâmicos utilizados para a modelação dos padrões de fluxo por análise de DTR, o modelo ‘tanques em série com retro-fluxo’ é altamente recomendado visto existir uma analogia física com a geometria CSP (diversas unidades perfeitamente agitadas e interligadas - as cavidades) e por considerar a existência de uma taxa de retrodispersão (G) entre as várias cavidades. A segunda parte do trabalho focou a aplicação do micro-bioreactor e do meso-reactor a três bioprocessos: i) crescimento aeróbio e anaeróbio da Saccharomyces cerevisiae no micro-bioreactor; ii) optimização da produção biotecnológica da γ-decalactona no micro-bioreactor; iii) renaturação da lisozima por diluição por partidas (no microbioreactor) ou em contínuo (no meso-reactor). Primeiramente, estudou-se a transferência de massa no micro-bioreactor por medição das taxas de transferência de oxigénio (kLa) num sistema gás-líquido. Averiguou-se o efeito de f e x0 sobre kLa e a fracção de gás (ε) para a um valor fixo de caudal volumétrico de gás vgas = 0.28 mL/min, o que permitiu encontrar uma correlação empírica para o kLa e relacionar kLa com os padrões de fluxo quer experimentalmente observados (por VIP), quer numericamente simulados (por DFC). Os estudos de kLa demonstraram que a transferência de massa de um sistema gáslíquido no micro-bioreactor é superior à obtida em outros sistemas de pequena-escala: kLa = 0.05 s-1 (para f = 0 - 20 Hz e x0 = 0 – 3 mm) a vgas = 0.28 mL/min. O aumento de kLa foi apontado como responsável pelo aumento em 83 % do rendimento de crescimento de biomassa em glucose (YX/S ) para a situação de crescimento aeróbio de S. cerevisiae, em comparação com os valores de YX/S obtidos num RPA. De igual modo, a diminuição em 50 % do tempo necessário para máxima produção de γ- decalactona com a levedura aeróbica restrita Yarrowia lipolytica sugere taxas de transferência de massa incrementadas neste sistema de quatro-fases, graças a um aumento da área de contacto entre as diversas fases. A natureza recíproca na MFO aumenta a interacção entre os elementos do fluido. Por isso, quer o micro-bioreactor quer o meso-reactor apresentam limitações na renaturação de lisozima por diluição, essencialmente quando em contínuo (com o meso-reactor). A intensa agregação proteica observada sugere que o meso-reactor poderá ser eficazmente utilizado como um sistema de pequena-escala para a produção contínua de bio-agregados e nano-partículas. Em suma, os dois novos sistemas de pequena-escala contribuirão, certamente, para acelerar o processo de projecto de bioprocessos, permitindo realizar experiências como elevada selectividade, reprodutibilidade e condições bem controladas