Desenvolvimento de um meio de cultura selectivo-diferencial para a levedura de contaminação alimentar Zygosaccharomyces Bailii

Dissertação de mestrado em Ciências do Ambiente, especialização em Qualidade AmbientalZygosaccharomyces bailii é uma levedura frequentemente associada a problemas de contaminação alimentar dada a sua capacidade de sobreviver em ambientes ácidos na presença de ácidos orgânicos fracos normalmente utilizados como conservantes químicos na indústria alimentar. Com vista a desenvolver um meio diferencial para Z. bailii recorreu-se a uma colecção de leveduras isoladas preferencialmente de vinhos contaminados. Assim, as estirpes seleccionadas para este estudo diferiram na sua origem e resistência a preservativos ácidos e pertenceram às espécies de Pichia membranaefaciens, Pichia anomala, Torulaspora delbrueckii, Dekkera anomala, Dekkera bruxellensis, Debaryomyces hansenii, Saccharomycodes ludwigii, Issatchenkia orientalis, Kluyveromyces marxianus, Kloeckera apiculata, Lodderomyces elongisporus, Schizosaccharomyces pombe, Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces florentinus e Zygosaccharomyces bailii. O desenho do meio de cultura baseou-se na diferente capacidade de crescimento, que as diferentes espécies de levedura apresentam em meio mineral com substrato simples (ácido carboxílico fraco) ou com substratos misto (açúcar e ácido carboxílico fraco) como únicas fontes de carbono e energia. Quando os ensaios foram conduzidos num meio líquido com substrato simples, a maior parte das estirpes apresentou capacidade de utilizar pelo menos um dos vários ácidos carboxílicos testados. A natureza do ácido e a sua concentração bem como a manipulação do pH do meio, associada à incorporação de um indicador ácido-base, permitiu seleccionar condições em que somente as estirpes de Z. bailii originavam variação de cor do meio (resposta positiva). Contudo, esta resposta só foi observada após 115 a 168 h. Quando se utilizou o meio com substratos misto (glucose 0,1 %, p/v e ácido fórmico 0,3 %, v/v), em todas as estirpes de Z. bailii observou-se resposta positiva após um período de tempo consideravelmente mais reduzido (cerca de 48 h) quando comparado com o meio com substrato simples para a mesma densidade de inóculo e para as mesmas condições de incubação. Utilizando quer microplacas, quer meio sólido, procedeu-se de seguida à avaliação do comportamento deste meio com substratos misto para as outras espécies da colecção. Em ambos os casos somente as espécies de Z. bailii apresentaram resposta positiva durante as primeiras 48 h de incubação. No entanto a estirpe IGC 4194 de Z. rouxii apresentou uma resposta falso-positiva. O aumento da concentração do ácido fórmico no meio com substratos misto a pH 4,5 (glucose 0,1 %, p/v e ácido fórmico 0,4 ou 0,5 %, v/v) traduziu-se de uma forma geral num aumento do tempo de resposta para algumas estirpes. Nestes ensaios incluiram-se também estirpes de Z. bisporus, algumas das quais evidenciaram uma resposta positiva. Considera-se assim os meios desenvolvidos como diferenciais/selectivos para estas duas espécies. A validação do meio com substratos misto revelou a sua equivalência a outros meios de cultura, já descritos na literatura, no que respeita à percentagem de recuperação de Z. bailii. No entanto, a vantagem da utilização do meio de cultura desenvolvido no presente trabalho, em contraste com os restantes meios, consiste na capacidade de diferenciação de Z. bailii de outras leveduras pela cor das colónias. A análise microbiológica de duas amostras de Vinho Verde contaminado permitiu concluir, que o meio com substratos misto apresentou-se como um meio diferencial adequado para distinguir Z. bailii de outras leveduras de contaminação, com aplicação prática no controlo microbiológico de vinho e potencialmente de outras bebidas e alimentos.Zygosaccharomyces bailii is a frequent food and beverage spoilage yeast, which is able to survive in acidic environments, in the presence of weak organic acids used as chemical preservatives. A collection of yeasts, isolated mostly from spoiled wines, was used in order to develop a differential medium for Z. bailii. The selected strains differed in their origin and resistance to acid preservatives, belonging to the species Pichia membranaefaciens, Pichia anomala, Torulaspora delbrueckii, Dekkera anomala, Dekkera bruxellensis, Debaryomyces hansenii, Saccharomycodes ludwigii, Issatchenkia orientalis, Kluyveromyces marxianus, Kloeckera apiculata, Lodderomyces elongisporus, Schizosaccharomyces pombe, Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pastorianus, Saccharomyces bayanus, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces florentinus and Zygosaccharo-myces bailii. The design of the culture media was based on the different ability of the various yeast species to grow in a mineral medium containing a single substrate (weak carboxylic acid) or mixed substrate (a sugar plus a weak carboxylic acid) as the only carbon and energy sources. When the assays were carried out in liquid medium with single substrate, most of the strains displayed ability to utilize at least one of the several weak carboxylic acids tested. The nature of the acid and its concentration as well as the manipulation of the pH of the medium, associated to the incorporation of an acid-base indicator, allowed to select conditions where only Z. bailii strains gave rise to change in colour of the medium (positive response). However, these positive responses were only obtained after about 115 to 168 h. When the mixed substrate medium (glucose, 0,1%, p/v and formic acid 0,3 %, v/v) was used, all the Z. bailii strains gave positive response after a considerably lower time (about 48 h) when compared with the single substrate medium for the same inoculum density and incubation conditions. Following these results, the mixed substrate medium was tested for the other species of the yeast collection, using either microplate wells or solid medium. In both cases, only the Z. bailii strains gave positive response during the first 48 h of incubation, and only one false positive response has been observed (Z. rouxii IGC 4194). The increase of the formic acid concentration in the mixed substrate medium at pH 4,5 (glucose, 0,1%, p/v and formic acid 0,4 or 0,5 % v/v, respectively) was associated to a prolonged response time, displayed by several Z. bailii strains. In these assays we included also strains of Z. bisporus, some of them exhibiting a positive response. Thus, the developed medium can be considered as diferential/selective for both species. The validation of the culture medium developed in the present work revealed its equivalence to other culture media previously described, concerning the percentage of recovery of Z. bailii. However, the major advantage of the developed medium, in contrast to other culture media, is its capability to diferentiate Z. bailii from other yeasts by the color of the colonies. The microbiological analysis of two samples of contaminated "Vinho Verde" ("Green Wine") allowed to conclude, that the mixed substrate medium can be considered as a differential medium to distinguish Z. bailii from other contamination yeasts, with potential application in the microbiological control of wines and probably other beverages and foods.Projecto Europeu "Spoilage Yeasts in Foods and Beverages - Characterization and Ecology for Improved Diagnosis and Control" - (AIR Project CT 93/830