Micoflora das uvas portuguesas e seu potencial para a contaminação das uvas com micotoxinas, com destaque para a ocratoxina A

Tese de doutoramento em Engenharia Química e BiológicaA contaminação dos alimentos com micotoxinas - metabolitos tóxicos produzidos por fungos filamentosos presentes nos alimentos - suscita preocupação por parte de comités alimentares e de diversas organizações governamentais quanto à protecção da saúde do consumidor. O estudo da contaminação alimentar com micotoxinas e as suas implicações na saúde dos consumidores são o ambito de estudo da micotoxicologia, área onde se insere a presente dissertação. Com este trabalho pretendeu-se contribuir para a avaliação do risco de contaminação de uvas e vinho com micotoxinas, com ênfase na micotoxina ocratoxina A (OTA). A OTA é a micotoxina mais frequentemente detectada no vinho, estando proposto um limite máximo para a presença deste contaminante nesta matriz de 2 μg/l, que aguarda adopção formal pela UE. Iniciou-se o estudo da dissertação com o rastreio da micoflora de uvas portuguesas destinadas ao fabrico de vinho em 4 regiões demarcadas (Alentejo, Douro, Ribatejo e Vinhos Verdes), estudadas durante 3 anos consecutivos, de 2001 a 2003. Acompanhou-se a evolução da micoflora ao longo da maturação das uvas até ao momento da vindima. Caracterizou-se a micoflora em cada estado de maturação e de cada região, e identificaram-se as estirpes de Aspergillus e Penicillium (incluindo os seus teleomorfos) isoladas, visto que estes são os únicos géneros capazes de produzir OTA. Foram detectadas e identificadas cerca de 11 mil estirpes de fungos filamentosos nas uvas. Foram identificadas espécies de Aspergillus capazes de produzir OTA, sendo as mais frequentes o agregado A. niger e A. carbonarius. Não foi identificada nenhuma espécie de Penicillium descrita como produtora de OTA nas uvas. Testaram-se as estirpes de Aspergillus quanto à capacidade de produzir a micotoxina em meios de cultura. Verificou-se que todas as estirpes de A. carbonarius produziram a micotoxina, ao contrário das estirpes do agregado A. niger, em que a capacidade de produzir OTA foi detectada em 4% das estirpes. Este estudo permitiu estabelecer A. carbonarius como a principal espécie produtora de OTA nas uvas portuguesas. Estirpes isoladas durante a dissertação morfologicamente semelhantes a A. carbonarius, mas com diferenças significativas no tamanho dos esporos, e em que não foi detectada OTA foram propostas como pertencentes a uma espécie distinta, designada na dissertação por A. ibericus, taxa cuja descrição formal está em curso. Determinou-se o teor de OTA nas uvas nos estados de maturação analisados, em uvas normais, sem podridão visível e em uvas com podridão visível. Detectou-se OTA desde os estados iniciais de maturação das uvas até à vindima. A OTA nas uvas aparentemente normais não excedeu os 0,12 μg/l na vindima, mas o teor de OTA num cacho em que foi detectada podridão visível por A. carbonarius foi de 7,5 μg/l. A presença de OTA desde os estadios iniciais de desenvolvimento do bago motivou um estudo da influência da composição do substrato na capacidade de produção de OTA por uma estirpe de A. carbonarius. Neste estudo verificou-se que o estado de maturação da uva influencia significativamente a capacidade de produção de OTA, sendo esta favorecida nos estados iniciais de maturação. Os resultados obtidos durante a dissertação estão de acordo com os dados reportados na literatura quanto à contaminação dos vinhos com OTA, em que se verificou uma dependência geográfica da contaminação, sendo os vinhos originários do Sul da Europa e Norte de África os mais contaminados. Os dados obtidos no decorrer da dissertação suportam a teoria de que a produção de OTA em uvas e vinho é devida a A. carbonarius, espécie presente com maior frequência em climas Mediterrânicos. O facto de as uvas aparentemente normais apresentarem níveis de contaminação muito baixos, quando comparadas com uvas podres, sugere que a presença de OTA no vinho originário de áreas de risco, onde foi detectada a presença de A. carbonarius nas uvas, pode ser devida a um mau estado fitossanitário das uvas vinificadas. Visto que a produção de OTA se faz por fungos filamentosos aeróbios, a contaminação com a micotoxina deve dar-se essencialmente antes da vinificação das uvas, uma vez que com o início da vinificação e fermentação, as condições se tornam desfavoráveis para o crescimento fungos filamentosos, e a microflora do mosto é dominada por leveduras. Por isso, recomenda-se como medida preventiva de contaminação com OTA que não sejam vinificadas uvas podres em áreas de risco. A análise da micoflora das uvas revelou que além da OTA, existe o perigo das uvas com podridão cinzenta estarem contaminadas com Trichothecium roseum, e eventualmente com metabolitos tóxicos produzidos por este fungo. Como conclusão do trabalho, os dados indicam que a contaminação das uvas destinadas ao fabrico de vinhos com OTA está fortemente ligada com a distribuição geográfica de A. carbonarius, salientando a necessidade de evitar vinificar uvas podres como principal medida preventiva da contaminação do vinho com OTA e outras micotoxinas. Adicionalmente, salienta-se que as uvas se revelaram interessantes do ponto de vista de biodiversidade, permitindo a descoberta duma espécie nova para a ciência.The contamination of food with mycotoxins – toxic metabolites in foods produced by filamentous fungi – is a concern to the consumers’ health. The process of food contamination with mycotoxins and implications to health is referred to as mycotoxicology. The main objective of the work presented here is to contribute to the risk assessment of mycotoxins in grapes and wines, particularly ochratoxin A (OTA). OTA is the mycotoxin detected most frequently in wine, and a maximum limit of 2 μg/l was proposed by the European Union, and awaits formal adoption by the Commission. The study was initiated with a survey of the mycoflora of Portuguese grapes destined for winemaking in 4 winemaking regions (Alentejo, Douro, Ribatejo e Vinhos Verdes) from 2001 to 2003. The evolution of mycoflora with maturation stage was evaluated. The mycoflora in each maturation stage and region was defined, investigating with particular intensity Aspergillus and Penicillium strains (together with their teleomorphic states), since these are the only genera known capable of OTA production. More than 11000 strains of filamentous fungi were identified from grapes. Aspergillus species capable of OTA production were found, the most relevant being A. niger aggregate and A. carbonarius due to their frequency. None of the Penicillium species isolated from the samples were known OTA producers. The Aspergillus strains were analysed with respect to ability to produce OTA in culture media. All the A. carbonarius strains produced the mycotoxin, while only 4% of the A. niger aggregate strains were able to produce the mycotoxin in detectable amounts. A. carbonarius was the principal OTA producing species from Portuguese grapes. Strains morphologically similar to A. carbonarius, with a significant difference in spore size when compared with the other species in the section Nigri, that did not produced the mycotoxin in detectable levels were considered as a new species, mentioned in the dissertation as A. ibericus, and the formal description of this taxa is in progress. The OTA content of grapes from various maturation stages were studied, using some clearly rotten. OTA was detected from the initial maturation stages up until harvest time. In normal grapes, the OTA content at harvest time was a maximum of 0,12 μg/l, The OTA content in a grape bunch with visible A. carbonarius rot was 7,5 μg/l. The presence of OTA at the initial berry stages motivated a study on the influence of substrate composition on OTA production using a single A. carbonarius strain. The substrate composition alters the OTA production significantly, with the composition of the berry in early maturation stages favouring OTA production. The results obtained are in agreement with the data reported previously in literature regarding OTA contamination of wines. It is known that wines originating from southern Europe and North Africa are the most contaminated. Data obtained support the theory that OTA production in grapes and wines is due to A. carbonarius, a species most frequent in Mediterranean climates. The fact that sound grapes had very low levels of OTA when compared to rotten grapes may indicate that OTA presence in wines is indicator of a poor quality of the grapes used in winemaking in areas where A. carbonarius is present. The fact that OTA is produced by aerobic filamentous fungi suggests the contamination of wine is made essentially before winemaking and fermentation. During grape must fermentation, the conditions are unfavourable for the growth of filamentous fungi, and the grape must microflora is dominated by fermenting yeasts. Therefore, is recommended not to use rotten grapes in the winemaking process in areas where A. carbonarius is present, as a preventive action against OTA contamination. Based on the mycoflora of grapes, there is a potential risk of contamination with other mycotoxins apart from OTA. Some grapes with visible grey rot were found to be contaminated with Trichothecium roseum, and therefore, there is a risk of contamination of grapes and wine with the metabolites produced by this species. As conclusion, the data presented here indicates that the contamination of grapes with OTA destined for winemaking is strongly associated with the geographical distribution of A. carbonarius, emphasizing the need to avoid using rotten grapes as the main preventive action to avoid wine contamination with OTA and other mycotoxins. Additionally, it is highlighted that grapes revealed an interesting filamentous fungi biodiversity, resulting in the discovery of a fungal new species for science, A. ibericus.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - SFRH/BD/1436/2000