Estirpes floculantes de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificadas para a utilização de lactose : construção e aplicação biotecnológica

Tese de doutoramento em Engenharia Química e BiológicaA biotecnologia, por definição, envolve a utilização de organismos vivos ou de componentes celulares derivados de organismos vivos. A tecnologia do ADN recombinante, devido à sua capacidade de efectuar alterações nas características de um organismo vivo, pode teoricamente ser empregue para modificar ou melhorar qualquer processo biotecnológico. No entanto, para que uma abordagem deste tipo seja bem sucedida é necessário que seja efectuada de forma híbrida entre a genética aplicada e o próprio processo. Desta forma, ao efectuar alterações ao nível da biologia molecular deve-se ter em conta o processo ao qual se pretende aplicar. Uma vez construído o novo microrganismo, a operação em biorreactor e optimização do processo não pode ignorar as suas características de microrganismo recombinante. Com o presente trabalho pretendeu-se contribuir para o melhoramento do processo biotecnológico de tratamento do soro de queijo através da construção de estirpes de Saccharoinyces cerevisiae floculantes utilizadoras de lactose. Inicialmente, a estirpe floculante S. cerevisiae NCYC869-A3/T1 capaz de metabolizar e fermentar a lactose, através da utilização dos genes de Kluyveromyces lactis, LAC4 (codificador para a ß-galactosidase) e LACI2 (codificador para a permease da lactose), apresentava algumas limitações na metabolização de lactose, fermentação em etanol e floculação que foram ultrapassadas. Esta estirpe recombinante foi estudada em sistema contínuo de elevada densidade celular, permitindo a obtenção de cerca de 11 g1¹h¹ de etanol quando operado com meio semi-sintético à taxa de diluição de 0,5 h¹. A utilização de permeado de soro como substrato para fermentação alcoólica foi testada, obtendo-se uma produtividade em etanol de cerca de 10 g1¹h¹ para o sistema operado a 0,45 h¹ de taxa de diluição. A utilização de concentrado de permeado de soro de queijo para diminuir os custos de destilação foi avaliada, tendo-se comprovado a capacidade da estirpe recombinante na fermentação de etanol para valores próximos do teoricamente esperado. No entanto, a operação em contínuo em sistema de elevada densidade celular não foi possível devido à desfioculação da biomassa. A utilização conjunta desta estirpe recombinante de levedura e uma estirpe de E. coli recombinante produtora da proteína GFP, permitiu confirmar a resistência destes sistemas a contaminações quando operados a taxas de diluição suficientemente elevadas. Construíram-se também estirpes S. cerevisiae floculantes e não floculantes, excretoras de ß-galactosidase através da clonagem do gene lacA de Aspergilius niger. A comparação de estirpes floculantes e não floculantes com o mesmo património genético permitiu verificar da viabilidade da produção de ß-galactosidase extracelular por células floculantes. Uma das estirpes construídas apresentou produção de ß-galactosidase comparável à obtida em sistemas comerciais de produção da enzima por fungos. Foi possível comprovar a pureza com que esta enzima é excretada para o meio extracelular, assim como a manutenção das suas propriedades, nomeadamente o óptimo de pH e de temperatura. A produção de ß-galactosidase pela estirpe recombinante foi estudada em sistema descontínuo e semi-contínuo tendo-se avaliado o efeito de diferentes parâmetros tais como, concentração inicial de lactose, taxa de arejamento e concentração de extracto de levedura. Verificou-se que o melhor sistema para produção de ß-galactosidase correspondia à concentração inicial de lactose de 100 g1¹ e 10 g1¹ de extracto de levedura com micro-arejamento. Aplicou-se a estirpe construída a sistema contínuo de elevada densidade celular, obtendo-se uma produtividade cerca de 6 vezes superior à obtida em sistema descontínuo. Foram também testados o permeado e o concentrado do permeado de soro de queijo como substrato, aplicando-se a enzima produzida à hidrólise do permeado de soro de queijo. Finalmente, desenvolveu-se uma estratégia para obtenção de estirpes modificadas com um plasmídeo contendo o gene de floculação e o de produção da ß-galactosidase. A obtenção da referida estirpe permitirá operar num sistema auto-selectivo, desde que se assegure a existência de uma cultura contínua de elevada densidade celular com capacidade de selecção de células floculantes. A estratégia desenvolvida para a construção do plasmídeo é apresentada e discutida.Biotechnology involves, by definition, the use of living organisms or cellular components of living organisms. Due to its ability to modify the properties of a living organism, the recombinant DNA technology can theoretically be employed to change or improve any biotechnological process. However, to be successful it is necessary to use a hybrid approach between applied genetics and the process itself. In this way, the modifications concerning the molecular biology stage must take into account the process that one wants to improve. Once the new organism has been constructed, the bioreactor operation and optimization stages must take into account the recornbinant organism properties. The aim of the present work was to contribute to the biotechnological improvement of cheese whey process treatment by the construction of lactose utilizing Saccharomyces cerevisiae flocculent strains. The flocculent strain S. cerevisiae NCYC869-A3/T1 is able to metabolise and ferment lactose by the utilization of the Kluyveromyces lactis genes, LAC4 (coding for ß-galactosidase) and LACI2 (coding for lactose permease). Initially, the recombinant strain presented some limitations concerning lactose metabolisation, ethanol fermentation and flocculation ability, that were overcome. This recombinant strain was used in a continuous high cell density system allowing for 11 g1¹h¹ ethanol productivity when fed with semisynthetic medium at 0.5 h¹ dilution rate. The use of cheese whey permeate as substrate for alcoholic fermentation was tested resulting in an ethanol productivity of 10 g1¹h¹ for 0.45 h¹ dilution rate. Aiming at decreasing the distillation costs, the use of cheese whey permeate concentrated two times was analysed, being the ability of the recombinant strain to ferment ethanol near the expected theoretically value confirmed. However, it was not possible to operate at continuous high cell density due to biomass deflocculation. Resistance to contamination of these systems when operating at high dilution rate was confirmed by the use of a recombinant E. coli strain producing the GFP protein. ß-Galactosidase secreting flocculent and non-flocculent S. cerevisiae strains were constructed by cloning the Aspergillus niger lacA gene. The comparison between flocculent and non-flocculent strains with the same genetic background confirmed the viability of producing extraceiluiar ß-galactosidase by flocculent yeast cells. One of the constructed strains presented ß-galactosidase production comparable to the one obtain in commercial systems by fungi. It was possible to confirm the secreted enzyme purity as well as the maintenance of its properties, namely the pH and temperature optima. The ß-galactosidase production was studied in batch and fed-batch culture. The effect of different parameters, such as, initial lactose concentration, aeration rate and yeast extract concentration were assayed. The best production was obtained with 100 g1¹ initial lactose concentration, 10 g1¹ yeast extract concentration and micro-aeration. The constructed strain was applied to a continuous high cell density system, allowing for a ß-galactosidase productivity 6 times higher than the one obtained with the batch system. The cheese whey permeate and the cheese whey permeate concentrated were used as substrates and the produced enzyme was applied to the cheese whey permeate hydrolysis. Finally, a strategy for obtaining strains harbouring a plasmid carrying the flocculation and ß-galactosidase genes was developed. Obtaining such a recombinant strain would allow for the operation of an auto-selective system, once the existence of a high cell density culture selective for flocculent cells is assured. The strategy developed is presented and discussed.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Programa PRAXIS XXI/11306/9