Glycerol transport in yeasts: physiological, molecular and phylogenetic approaches

Glycerol is a key compound in the regulation of several metabolic pathways in yeasts. In Saccharomyces cerevisiae, most of the genes involved in glycerol consumption, production and transport are now available. Previous studies evidenced that in S. cerevisiae glycerol could permeate the plasma membrane by two simultaneous and independent processes. A channel encoded by the gene FPS1, is responsible for glycerol diffusion as well as for its efflux/retention upon osmotic shock. A proton symporter, derepressed by growth on non-fermentable carbon sources, is responsible for glycerol active transport. This was associated with GUP1 and GUP2 genes. It was demonstrated that the combined deletion of GUP1, GUP2 together with GUT1 (glycerol kinase) was necessary to abolish active transport in cells cultivated on ethanol, i.e. on derepression conditions. As the previous results were not conclusive in relation to the affiliation of the function of Gup1and Gup2p, we focused on further clarifying glycerol transport mechanisms in yeasts. Considerable symporter activity was measured in gup1gup2gut1 mutants grown on glucose under salt-stress, particularly high in cells collected during diauxic-shift. This result was confirmed in other mutant combinations of the genes GUP1/2, GUT1 and FPS1. These results showed that the transport regulation could be activated by the combination of derepression/diauxic shift with osmotic stress. Concomitantly, a search for GPD1/2, GUT1, GUP1/2 and FPS1 orthologues in a series of hemiascomycetous yeasts was performed. All the genes cloned were able to complement S. cerevisiae mutant phenotypes and presented a high degree of similarity to the corresponding genes in this yeast. Phylogenetic analysis suggested the allocation of Gup proteins in the MBOAT (Membrane Bound O-Acyl Transferases) family, which includes enzymes from the plasma membrane. This is suggested as more valid than their inclusion in the TC-DB/Glycerol Uptake family. Besides, a Southern blot analysis was done to identify the glycerol related genes mentioned above in yeasts, besides S. cerevisiae, from which glycerol transport had been physiologically characterized and which genome was either navailable or just partially sequenced. From these we stress the results from FPS1 probe. Considering that all the studied yeasts presented linear glycerol entry besides active transport, the presence of Fps1p-like channels in all yeasts was predicted. Results were positive, as expected, in Z. rouxii, K. marxianus and P. angusta, but negative in C. halophila, P. sorbitophila, D. hansenii, C. albicans and C. tropicalis, suggesting that glycerol permeation must occur in these yeasts through very different proteins. The clarification of the reason underlying this difference will need further approaches. Recently, glycerol accumulation has been associated with Candida albicans pathogenecity/infectious ability. We consequently chose to characterize glycerol transport in C. albicans. Experiments revealed the presence of a specific and constitutive proton/glycerol symport, not affected by osmotic shock. Gup1p is not responsible for this active transport, since the mutant strain presents the same kind of glycerol transport of the wild type. The kinetics and patterns of glycerol export are similar to S. cerevisiae’s, suggesting the involvement of a channel mediated transport. Yet, the only C. albicans gene AQY1 that is homologous to S. cerevisiae FPS1 is apparently not involved in the observed glycerol efflux. As the obtained results suggested that Gup1p and Gup2p were not glycerol transporters, two strategies were developed in order to find further genes involved in glycerol transport. The first corresponded to the use of a transposonmutagenized library to transform S. cerevisiae fps1 mutant in order to isolate clones deficient in glycerol utilization. This strategy was unsuccessful due to difficulties in the fps1 strain transformation. The second corresponded to a screen for glycerol defective growth of the EUROSCARF mutant collection. Several genes putatively involved in glycerol consumption were isolated, but not on transport, since they all proved to be able to accumulate glycerol against its chemical gradient. Taking into consideration all the results here presented and discussed, we can state that GUP1 and GUP2, despite their involvement in glycerol transport, do not encode the glycerol carrier. Furthermore, we showed that glycerol active transport in S. cerevisiae, besides being induced by non-fermentable carbon sources, is also induced by salt stress, particularly during diauxic shift, i.e., during the transition from fermentative to respiratory metabolism. It became evident that several genes are involved in glycerol uptake, though their roles are not yet completely understood. Besides, it outstands from this work the notion that phylogenetic analysis is a powerful tool for suggesting protein roles but that it cannot be taken de per se as an indication of protein function.O glicerol é um composto fundamental na regulação de vários processos celulares em diferentes leveduras. Em Saccharomyces cerevisiae, uma parte dos genes envolvidos no seu consumo e produção, bem como no seu transporte, estão presentemente identificados. Nesta levedura, estudos prévios demonstraram que o glicerol pode permear a membrana através de dois processos independentes, um simporte com protões e um canal. Enquanto que o simportador se apresenta regulado pela glucose, induzido por crescimento em fontes de carbono não fermentáveis, o gene que codifica para o canal, FPS1, é constitutivamente expresso, sendo responsável pela difusão do glicerol e pelo seu efluxo/retenção em situações de choque osmótico. Os genes GUP1 e GUP2 foram associados ao transporte activo do glicerol. No entanto, só combinando a sua delecção com a do gene GUT1, que codifica para a primeira enzima da via catabólica do glicerol, é que se consegue abolir o transporte deste substrato em células cultivadas em condições de desrepressão. Neste trabalho foi medido transporte activo de glicerol no mutante triplo, gup1gup2gut1, desde que cultivado em glucose com 1M NaCl, particularmente activo na fase diauxica de crescimento. Este novo resultado foi confirmado em outros mutantes, com diferentes combinações das delecções nos genes GUP1/2, GUT1 e FPS1. Mostrou-se a indução do transportador pela conjugação da desrepressão/fase diauxica com o stress osmótico. Concomitantemente, foi realizada uma pesquisa nas bases de dados de genomas de leveduras, de ortólogos dos genes de S. cerevisiae GUP1/2, FPS1 e GUT1 acima mencionados. Foram ainda incluídos nesta pesquisa os isogenes GPD1/2, que codificam para glicerol 3-fosfato desidrogenases citoplasmáticas. Posteriormente, uma grande parte das ORFs encontradas foram clonadas e usadas para complementar fenotipicamente os respectivos mutantes de S. cerevisiae. A análise filogenética realizada sugeriu que as proteínas codificadas pelos genes GUP deviam ser incluídos na extensa família de proteínas MBOAT (membrande bound O-acyl tranferases), que agrupa enzimas, acil-transferases, associadas à membrana plasmática. Dada a forte semelhança entre as sequências encontradas e o grau de conservação das proteínas desta família, considera-se não ser válido continuar a incluir as Gup1/2p na família de proteínas transportadoras que lhes tinha sido atribuída anteriormente. Foi também feita uma análise de Southern para identificar ortólogos desses genes em leveduras para as quais o transporte de glicerol tinha sido fisiologicamene caracterizado, mas cujo genoma não se encontra disponível ou não estava ainda sequenciado na sua totalidade à altura do trabalho. Desses resultados, salientamos os que dizem respeito à sonda FPS1. Tendo em consideração que todas as leveduras estudadas apresentaram entrada linear de glicerol para além do transporte activo, era de esperar a existência em todas elas de proteínas análogas a Fps1p. A sonda hibridou, tal como esperado, contra o genoma de Z. rouxii, K. marxianus, e P. angusta, mas não contra o genoma de C. halophila, P. sorbitophila, D. hansenii, C. albicans e C. tropicalis, sugerindo que a permeabilização de glicerol se fará nas leveduras deste segundo grupo por proteínas muito diferentes de Fps1p. A clarificação das razões subjacentes a este resultado necessita de mais trabalho experimental. Uma das leveduras cuja base de dados sugeria a presença de um gene homólogo ao GUP1 foi Candida albicans, um conhecido patogénico da espécie humana. Nesta, a síntese e acumulação de glicerol foi recentemente associada à sua patogenicidade, tendo desta forma adquirido um interesse especial. Por esta razão, fomos caracterizar o transporte de glicerol nesta levedura. Os resultados revelaram a presença de um simportador glicerol/protão específico, constitutivo e não afectado pelo sal. A proteína CaGup1, que apresenta um elevado grau de semelhança a ScGup1p, não pode ser responsável por este transporte, pois o mutante deleccionado nesse gene apresentava o mesmo tipo de transporte da estirpe selvagem. Para além disso, o efluxo de glicerol observado após choque hipo-osmótico foi semelhante ao que foi descrito para S. cerevisiae, sugerindo o envolvimento de um canal mediador. No entanto, o único gene com alguma similaridade com o FPS1 de S. cerevisiae, o gene AQY1, não parece estar envolvido neste processo. Como os resultados anteriores sugeriam que o transportador activo de glicerol não era codificado pelos genes GUP1/2, e no intuito de prosseguir com a pesquisa do gene codificante do transportador, foram utilizadas duas estratégias. A primeira consistiu em usar uma biblioteca de transposões para mutagenizar uma estirpe de S. cerevisiae deleccionada no gene FPS1, com o intuito de isolar clones com fenótipo em glicerol. Esta estratégia não resultou devido às dificuldades em transformar a referida estirpe. A segunda consistiu na pesquisa de fenótipo em glicerol da colecção de mutantes simples da EUROSCARF. Foram isolados clones presumivelmente envolvidos no consumo de glicerol, mas não no seu transporte, dado que todos demonstraram ter capacidade para acumular glicerol contra o seu gradiente químico. Tendo em consideração todos os resultados obtidos, pode-se inferir que os genes GUP1 e GUP2, apesar de envolvidos no transporte de glicerol não codificam para o simportador de glicerol. Para além disso, mostrou-se que o transporte activo do glicerol em S. cerivisiae, além de induzido por fontes de carbono não fermentáveis também é induzido pelo stresse salino, em particular durante a fase diauxica de transição fermento/respirativa. Ficou ainda evidente o envolvimento de vários genes no transporte de glicerol, apesar dos seus papéis ainda não serem completamente compreendidos. Deste trabalho ressalta ainda a noção de que a análise filogenética é uma ferramenta fundamental em proteómica, mas que as conclusões que daí se podem retirar têm de ser interpretadas com algum cuidado, porque nem sempre as semelhanças em termos de sequências correspondem a semelhanças funcionais.PRODEP (n.º 2/2000 Ref.ª 53/258.002/00)