Análise da variabilidade genética e identificação de espécies do gênero Atta (Hymenoptera: Formicidae) por meio de marcadores moleculares

Orientador: Dr. Luiz Gonzaga Esteves VieiraTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Entomologia)Inclui referências: p. 116-134Área de concentração: EntomologiaResumo: A variabilidade genética de espécies e subespécies do gênero Atta (Hymenoptera: Formicidae) foi analisada por meio de marcadores moleculares, empregando-se as técnicas PCR-RAPD (polymerase chain reaction - randomly amplified polymorphic DNA) e PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) da região ITS (internai transcribed spacers) do DNA ribossômico. Para alcançar os objetivos propostos foram desenvolvidos quatro trabalhos, sendo que inicialmente foram selecionaddos métodos de preservação para Atta spp., visando a obtenção de DNA em quantidade e qualidade suficientes paras as análises. Constatou-se que por um período de até sete meses, a preservação pode ser feita em qualquer um dos sistemas avaliados: -70°C, etanol 95% a -20°C, etanol 95% a 4°C, etanol 95% à temperatura ambiente (TA), sílica gel à TA e tampão de extração à TA. Para um período de até 12 meses, com exceção da preservação em etanol 95% à TA, a preservação poderá ser feita em qualquer dos métodos avaliados. Posteriormente, determinaram-se as condições ótimas para a utilização da técnica PCR-RAPD, através da avaliação de alguns parâmetros com maior influência na eficiência da reação, utilizando-se os delineamentos estatísticos fatorial fracionado e central composto. Os melhores perfis de bandas de PCR-RAPD foram obtidos com as seguintes condições: 1 X tampão [10 mM Tris-HCI (pH 9,0), 3,0 mM Mg2+, 50 mM KCI], 100 pM de cada dNTP, 0,2 pM de primer, 1,0 U de Taq polimerase, 25 ng DNA e BSA 0,05%, utilizando-se o programa de amplificação: 3 min a 94°C, 3 min a 35°C, seguidos de 40 ciclos de 1 min a 94°C, 1 min a 36°C e 2 min a 72°C, com extensão final de 5 min a 72°C. Na análise da diversidade genética de oito espécies e duas subespécies do gênero Atta por meio de PCR-RAPD, 206 fragmentos polimórficos gerados por 11 primers foram selecionados. A análise de agrupamento utilizando o método UPGMA, sobre uma matriz de similaridade calculada pelo coeficiente de Jaccard, permitiu distribuir as espécies em quatro grupos: I) Atta sexdens piriventris, Atta sexdens rubropilosa, Atta sexdens sexdens e Atta robusta-, II) Atta opaciceps; III) Atta capiguara, Atta vollenweideri, Atta laevigata, Atta sp. e Atta bisphaerica; IV) Atta cephalotes. Esses grupos correspondem, em sua maioria, aos subgêneros estabelecidos por Borgmeier em 1959. Por meio de PCR-RAPD, alguns fragmentos polimórficos facilmente identificáveis (presentes em alguns indivíduos, ausentes em outros), gerados pelos primers OPA-03, OPA-07 e OPA10, permitiram a identificação das espécies e subespécies analisadas. A análise da região ITS do DNA ribossômico das espécies de Atta permitiu demonstrar que essa região pode ser útil para agrupar as espécies dentro de subgêneros, confirmando os resultados obtidos na análise da diversidade, assim como para identificar algumas espécies.Abstract: The genetic variability of species and subspecies of the genus Atta (Hymenoptera: Formicidae) was analyzed by means of molecular markers, using PCR-RAPD (polymerase chain reaction - randomly amplified polymorphic DNA) and PCR-RFLP (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) of the ITS region (internal transcribed spacers) of the ribosomal DNA. To reach the proposed objectives, four experiments were carried out. First, methods were studied to preserve Atta spp. for extraction of high amounts of good quality DNA to be used in RAPD analysis. The data showed that the insects can be well preserved up to seven months in any one of the studied systems: -70°C, ethanol 95% at -20°C, ethanol 95% at 4°C, ethanol 95% at room temperature (RT), silica gel at RT and extraction buffer at RT. For a period of up to 12 months, except for the preservation in ethanol 95% at RT, DNA with quality could be extracted using any of the methods. Subsequently, the optimum conditions for PCR-RAPD were determined using fractional factorial and central composite statistical designs to evaluate some parameters with large influence in the reaction efficiency. The best band profiles were obtained with the following conditions: 1 X buffer [10 mM Tris-HCI (pH 9,0), 3,0 mM Mg2+, 50 mM KCI], 100 mM of each dNTP, 0,2 primer mM, 1,0 U of Taq polymerase, 25 ng DNA and BSA 0,05%, using the amplification program: 3 min at 94°C, 3 min at 35°C, followed by 40 cycles of 1 min at 94°C, 1 min at 36°C and 2 min at 72°C, with a final extension step of 5 min at 72°C. To assess the genetic diversity of eight species and two subspecies of the genus Atta through PCR-RAPD, eleven arbitrary primers were selected, generating 206 polymorphic fragments. The grouping analysis using the UPGMA method on a similarity matrix calculated by the coefficient of Jaccard, sub-divided the species in four groups: I) Atta sexdens piriventris, Atta sexdens rubropilosa, Atta sexdens sexdens e Atta robusta\ II) Atta opaciceps; III) Atta capiguara, Atta vollenweideri, Atta laevigata, Atta sp. e Atta bisphaerica\ IV) Atta cephalotes. These groups fit quite well into the established subgenus described by Borgmeier em 1959. Clearly distinctive polymorphic fragments (presents in some individuals, absent in others) generated by the primers OPA-03, OPA-07 and OPA-10 allowed the identification of the species and subspecies used in this study. Finally, the PCR-RFLP analysis of the ITS region of the ribosomal DNA of the Atta species demonstrated that this region is useful to group the species in subgenera, confirming the results obtained with PCR-RAPD, as well as to identify some species