Produção, caracterização e atividades biológicas de caseinofosfopeptídeos obtidos por hidrólise tríptica

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Almeriane Maria Weffort-SantosCoorientadora: Prof.ª Dr.ª Claudia Carneiro Hecke KrugerDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Segurança Alimentar e Nutricional. Defesa: Curitiba, 12/07/2013Inclui referências: p. 115-130Resumo: Há grande interesse no estudo da relação entre nutrição e imunidade devido à hipótese de que o consumo de determinados alimentos pode reduzir a susceptibilidade e/ou a progressão de doenças associadas à resposta imunológica. O objetivo desse estudo foi produzir, caracterizar e conhecer as atividades biológicas de caseinofosfopeptídeos (CPP) nas respostas inflamatória, antimicrobiana e antioxidante. Para tanto, CPP foram produzidos por hidrólise tríptica do caseinato de sódio, seguida de precipitação ácida, agregação mineral e precipitação com etanol, sob as condições de 2 e 4horas de hidrólise, à 37ºC e 50ºC. Em seguida, foram caracterizados através de avaliação da composição centesimal, Eletroforese em Gel de Poliacrilamida, Espectometria de Massas e por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. Posteriormente, leucócitos humanos de indivíduos sadios para os quais os CPP não se mostraram tóxicos foram utilizados nos seguintes ensaios: (a) expressão das integrinas LFA-1, VLA-4 e VLA-5 por citometria de fluxo; (b) quimiotaxia de granulócitos em câmaras de Boyden, (c) atividade antimicrobiana para Escherichia coli e Salmonella enteritidis em teste de microdiluição em caldo e (d) determinação da capacidade antioxidante, usando os métodos de redução do fosfomolibdênio e espécies reativas do ácido tiobarbitúrico (TBARS). Os resultados mostraram que os CPP obtidos apresentam baixo peso molecular e elevados teores proteico e mineral; quanto ao perfil aminoacídico, apresentam elevada e diferenciada quantidade de ácido glutâmico e serina, conforme o processo de obtenção. Quanto às atividades biológicas, os CPP não influenciaram a expressão de LFA-1. Para VLA-4, entretanto, os CPP 2h/37ºC diminuíram significativamente a expressão em linfócitos, CPP 2h/50ºC diminuíram significativamente a expressão em granulócitos, e os CPP 4h/37ºC e 50ºC aumentaram significativamente a expressão da mesma integrina em granulócitos. Em relação à VLA-5, os CPP 4h/37ºC e 50ºC aumentaram significativamente sua expressão em linfócitos e granulócitos. Os CPP 4h/37ºC e 50ºC h apresentaram habilidade em promover significativamente a locomoção de granulócitos, em contraste com os CPP 2h/37ºC e 50ºC, que a inibiram. Todos os hidrolisados apresentaram atividade antimicrobiana para E. coli e S. enteritidis. Mostraram-se, também, dotados de capacidade antioxidante, a qual foi melhor revelada pelo ensaio do TBARS. Os resultados deste trabalho indicam, pela primeira vez, que CPP derivados de hidrólise tríptica podem contribuir para com a resposta inflamatória não específica e, por apresentam atividades antimicrobiana e antioxidante, podem ser úteis na promoção da saúde em situações especiais que envolvem pacientes desnutridos e imunodeprimidos ou com comprometimento gastrintestinal decorrente de inflamações.Abstract: The interest in the study of the relationship between nutrition and immunity is increasing due to the hypothesis that the consumption of certain foods can reduce the susceptibility or the progression of diseases associated with the immune response. The aim of this study was to produce, characterize, and evaluate the biological activities of caseinphosphopeptides (CPP) in the inflammatory response as well as their antimicrobial and antioxidant abilities. To this end, CPP were produced by tryptic hydrolysis of sodium caseinate followed by acid precipitation, mineral aggregation, and precipitation with ethanol, during 2 and 4hours at 37 and 50 °C. They were, then, characterized by assessing their centesimal composition, and by Polyacrylamide Gel Electrophoresis, Mass Spectrometry, and High-performance Liquid Chromatography. After showing no cytotoxicity, human peripheral leukocytes from healthy subjects were exposed to the CPP and tested for (a) the integrins LFA-1, VLA-4, and VLA-5 expression by flow cytometry; (b) chemotaxis of granulocytes in Boyden chambers, (c) antimicrobial activity against Escherichia coli and Salmonella enteritidis by the microdilution test, and (d) determination of the antioxidant capacity, using the phosphomolybdenum and the thiobarbituric acid reactive species (TBARS) methods. The results showed that the CPP had high protein and mineral content, and low molecular weight; the amino acid profile showed high and differentiated amounts of glutamic acid and serine according to the methodological procedures. With regard to the biological activities, the CPP did not influence the expression of LFA-1. For VLA-4, however, the CPP 2h/37°C decreased significantly its expression on lymphocytes as did the CPP 2h/50°C for granulocytes, and in contrast with the CPP 4h/37ºC and 50°C, which significantly increased its expression integrin in granulocytes. Both the CPP 4h /37ºC and 50°C significantly increased VLA-5 expression in lymphocytes and granulocytes. The CPP 4h/37ºC and 50°C showed ability to induce granulocyte locomotion, in contrast with the inhibition showed by CPP 2h/37ºC and 50°C. All hydrolysates showed antimicrobial activity for E. coli and S. enteritidis. They were also have demonstrated antioxidant capacity, which was better revealed by the TBARS assay. The results of this study indicate, for the first time, that CPP derived by tryptic hydrolysis of sodium caseinate can influence the non-specific inflammatory response, and as having antimicrobial and antioxidant activities, they may be helpful in promoting health in special conditions involving malnourished and immunocompromised patients or with gastrointestinal impairment due to inflammation