IMAGERIE PAR RESONANCE DES PLASMONS DE SURFACE POUR L'ANALYSE SIMULTANEE DE MULTIPLES INTERACTIONS BIOMOLECULAIRES EN TEMPS REEL

The current growing requirements, in the field of biomolecular interactions analysis, require the development of automated high throughput systems like fluorescence microscopy that remains the method of choice. Although direct methods (without labeling of the molecules to be analyzed) have a lower sensitivity than those using labels, their many advantages (real time monitoring, simplification of the sample preparation) are of importance for biomolecular interactions quantitiative analysis. Moreover, the surface plasmon resonance imaging allows simultaneous measurements of many interactions like the methods with labels. To implement such a device, we identified its various critical parameters, likely to be improved, like the nature of the metal layer. The use of the thus developed sensor relies largely on surface chemistry: we have chosen the electrochemical synthesis of polypyrrole films that allows, in a controlled and structured manner, a simple and robust functionalization of spots containing various molecules. In parallel, an adequate home-developed software, including acquisition of images whose processing allows the real time monitoring of the biomolecular reactions occurring on each spot and the extraction of their association rate, dissociation rate and affinity constant between molecules. Lastly, we demonstrated the application possibilities of this system to the stufy of hereditary diseases or cancer through DNA/DNA (K-ras), DNA/protein (p53), protein/protein (hCG) and oligosaccharide/protein interactions (HP6/SDF-1).Les besoins actuels grandissants pour l'analyse des interactions biomoléculaires nécessitent le développement de systèmes automatisés à forte capacité et haut débit comme la microscopie de fluorescence qui reste une méthode de prédilection. Bien que les méthodes directes (sans marquage des molécules à analyser) présentent une sensibilité plus faible que celles utilisant des marqueurs, leurs nombreux avantages (suivi en temps réel, préparation simplifiée des échantillons) sont des atouts d'importance pour l'analyse quantitative des interactions biomoléculaires. En outre, l'imagerie en résonance des plasmons de surface permet de mesurer simultanément de nombreuses interactions comme les méthodes avec marqueurs. Pour élaborer un tel dispositif, nous avons d'abord identifié les différents paramètres critiques, susceptibles d'être améliorés, comme la nature de la couche métallique. L'utilisation du capteur ainsi développé repose en grande partie sur la chimie de surface: nous avons choisi la synthèse électrochimique de films de polypyrrole qui permet, de manière contrôlée et structurée, une fonctionnalisation simple et robuste de plots contenant diverses molécules. Parallèlement, nous avons développé un programme d'acquisition d'images dont le traitement permet de suivre en temps réel les réactions biomoléculaires sur chaque plot et d'en extraire constantes d'association, de dissociation et d'affinité entre molécules. Enfin, nous avons démontré les possibilités d'application de ce système à l'étude de maladies héréditaires ou du cancer à travers des interactions ADN/ADN (K-ras), ADN/protéines (p53), protéines/protéines (hCG) et oligosaccharides/protéines (HP6/SDF-1)