Risque de salmonellose humaine liée à la consommation de fromage à pâte molle au lait cru : développement d'un modèle pour l'appréciation quantitative du risque

Salmonellae are one of the most important causes of foodborne illness associated with raw dairy products. The assessment of the real risk associated with the consumption of these products is needed and the most appropriate method to achieve this goal is the risk analysis process which links pathogens in food to the public health problem. The main aim of this thesis is to quantitatively assess the risk of human salmonellosis linked to the consumption of Camembert cheese made from raw milk. A data gap that is routinely identified in risk assessment is the lack of quantitative data on pathogens contaminated food. Therefore, as a first objective of this thesis, we developed a rapid, sensitive and reliable method for the quantification of Salmonella in artificially contaminated milk samples. The method combined the principles of most-probable-number (MPN) method with a real-time PCR assay. With this developed assay (MPN-real-time PCR) low levels of Salmonella (1-5 CFU/mL) in milk could be enumerated after 8 h of non-selective enrichment in buffered peptone water. All estimated MPN counts corresponded well to the estimated contamination level of Salmonella inoculated into milk samples. In order to evaluate the utility of this developed quantification assay, our second objective was to apply it to naturally contaminated bulk tank milk samples collected from dairy farms located in western France. Eight (2.68%) of 299 bulk tank milk samples were found positive, with estimated MPN values ranging from 3.7 to 79.2 MPN/mL of milk. Despite the PCR inhibitors that were apparently present in some raw bulk tank milk samples, the application of the MPN-real-time PCR assay for quantifying Salmonella in raw milk proved to be rapid, easy-to-perform and highly sensitive. In the assessment of potential risks associated with Salmonella in raw milk and raw milk products it was necessary to examine the ability of Salmonella to grow in milk. Therefore, we presented in this thesis as a third v objective, primary and secondary models describing mathematically the growth of two Salmonella strains (S. Typhimurium and S. Montevideo) in milk under constant temperatures during different incubation periods. The primary logistic-with-delay model was used to describe Salmonella growth as a function of time. The specific growth rates of S. Typhimurium and S. Montevideo varied according to serotype and temperature. The maximum growth rates were then modeled as function of temperature using the secondary cardinal Rosso model. The reported cardinal estimates obtained with S. Typhimurium and S. Montevideo were: Tmin 3.02, 3.40; Topt 38.44, 38.55 and Tmax 44.51, 46.97°C, respectively. At the optimum growth temperature (Topt) the maximum growth rates were 1.36 and 1.39 log10 CFU/h-1 for S. Typhimurium and S. Montevideo respectively. Both the primary and secondary models fitted growth data well with a high-pseudo R2 (0.97-99). Finally, a quantitative risk assessment of human salmonellosis linked to the consumption of Camembert cheese made from raw milk is presented. Different distributions were assumed for the parameters of the model and a Monte Carlo simulation was used to model the process and to quantify the risk associated with the consumption of 25 g serving of cheese. The 99th percentile of Salmonella cell numbers in servings of 25 g of cheese was 5 cells at the time of consumption, corresponding to 0.2 cells of Salmonella per gram. The risk of salmonellosis per 25 g serving varied from 0 to 1.2 × 10-7 with a median of 7.4 × 10-8. For 100 million servings of 25g, the expected number of cases of salmonellosis predicted by the model is in average of 7.4. When the prevalence was reduced in the model by a factor of 10, the number of cases per 100 million servings was reduced to less than 1 case. Despite the limitations and the data gap, we demonstrated the benefit of risk assessment not only as a risk evaluation tool but also as a helping device in the decision-making and the risk management.Les salmonelles sont l'une des causes les plus importantes de maladie transmise par les produits laitiers crus. L'appréciation du risque associé à la consommation de ces produits est nécessaire et la méthode la plus appropriée pour réaliser ce but est l'utilisation du processus d'analyse de risque qui associe les microbes pathogènes dans l'aliment au problème de santé publique. Le but principal de cette thèse est donc d'évaluer quantitativement le risque de salmonellose humaine lié à la consommation de Camembert fromage au lait cru. Les lacunes qui sont en général identifiées pour l'appréciation des risques sont le manque de données quantitatives sur les microbes pathogènes contaminant les aliments. Donc, comme premier objectif de cette thèse, nous avons developeé une méthode rapide, sensible et fiable pour la quantification des salmonelles dans le lait artificiellement contaminé. La méthode a combiné les principes de la méthode du nombre-le plus-probable (NPP) avec une analyse PCR en temps réel. Avec cette analyse (NPP-PCR en temps réel) fiable niveau de la contamination (1- 5 ufc/mL) du lait peut être énuméré après 8 h d'enrichissement non-sélectif dans l'eau peptone tamponée. Toutes les valeurs de nombre le plus probable ont bien correspondu au niveau estimé de contamination des salmonelles inoculées dans des échantillons de lait. Afin d'évaluer l'utilité de cette analyse de quantification, nous l'avons appliquée aux échantillons naturellement contaminés de lait de tank d'exploitations laitières situées dans l'Ouest de la France. Huit (2,68%) des 299 échantillons de lait de tank étaient trouvés positifs, avec des comptes estimés de nombre plus probable s'étendant de 3,7 à 79,2 /mL de lait. En dépit des problèmes d'inhibition observés avec quelques échantillons de lait, l'application de l'analyse par PCR en temps réel pour mesurer des salmonelles dans le lait cru s'est avérée être rapide, facile à exécuter et extrêmement sensible. Dans l'appréciation des risques potentiels liés aux salmonelles dans le lait cru et les produits à base de lait cru il était nécessaire d'examiner la vii capacité des salmonelles à se développer dans le lait. Par conséquent, nous présentons dans cette thèse des modèles primaires et secondaires décrivant mathématiquement la croissance des salmonelles (S. Typhimurium et S. Montevideo) dans le lait à température constante pendant différentes périodes d'incubation. Le modèle logistique avec délai a été employé pour décrire la croissance des salmonelles en fonction du temps. Les taux de croissance spécifiques de S. Typhimurium et de S. Montevideo différent selon le sérotype et la température. Les taux de croissance maximum ont été alors modélisés en fonction de la température en utilisant le modèle cardinal secondaire de Rosso. Les valeurs cardinales obtenues avec S. Typhimurium et S. Montevideo étaient: Tmin 3,02, 3,40 ; Topt 38,44, 38,55 et Tmax 44,51, 46,97°C, respectivement. À la température optimum de croissance (Topt) les taux de croissance maximum étaient 1,36 et 1,39 log10 ufc/h-1 pour S. Typhimurium et S. Montevideo respectivement. Les modèles primaires et secondaires ont permis de bons ajustements aux données de croissance avec un pseudo R2 = 0.97-0.99. Un modèle d'appréciation du risque de salmonellose humaine liée à la consommation de Camembert au lait cru est présentée qui est basée sur les résultats des objectifs précédemment mentionnés dans cette thèse. Différentes distributions ont été posées en hypothèse pour des paramètres du modèle et une simulation de Monte Carlo a été employée pour modeler le processus et pour mesurer le risque lié à la consommation de la portion de 25 g du fromage. Le 99th percentile du nombre de cellules de salmonelles dans les portions de 25 g de fromage était 5 cellules à l'heure de la consommation, correspondant à 0,2 cellule des salmonelles par gramme. Le risque de salmonellose par portion de 25 g est compris entre 0 et 1,2 × 10-7 avec une médiane de 7,4 × 10-8. Pour 100 millions de portions de 25g, le nombre de cas de salmonellose prévue par le modèle est en moyenne de 7,4. Quand la prévalence est réduite dans le modèle d'un facteur de 10, le nombre de cas par 100 millions de portions est réduit à moins de 1 cas. En dépit des limites et des données manquantes, nous avons démontré l'avantage de l'appréciation du viii risque non seulement comme outil d'évaluation de risque mais également comme dispositif d'aide à la prise de décision et à la gestion des risques