Metabolismo fermentativo nel lievito K.lactis: regolazione ossigeno-dipendente e autoregolazione del gene KlPDC1

Nel lievito non convenzionale Kluyveromyces lactis, il gene KlPDC1 codifica per l'unica piruvato decarbossilasi, che catalizza la prima reazione della via fermentativa, la conversione del piruvato in acetaldeide. KlPDC1 è soggetto a diversi meccanismi di regolazione trascrizionale, tra cui l'induzione da glucosio, la repressione da etanolo e la regolazione ossigeno-dipendente; inoltre, il gene KlPDC1 è soggetto ad autoregolazione, un meccanismo di regolazione feedback in cui la proteina Pdc1 reprime la propria espressione. Il presente lavoro di dottorato ha avuto come oggetto lo studio di due di questi meccanismi: l'autoregolazione e la regolazione ossigeno-dipendente. Secondo il modello da noi elaborato, nel meccanismo di autoregolazione la proteina Pdc1 interagisce con l'attivatore trascrizionale Rag3, impedendone il legame al promotore di KlPDC1 e determinando una diminuzione dell'espressione del gene. L'interazione fisica tra le due proteine è stata dimostrata attraverso esperimenti di co-immunoprecipitazione e saggi two hybrid, mentre è ancora da chiarire quale sia il compartimento cellulare (nucleo o citoplasma) in cui ha luogo tale interazione. Esperimenti di real time pcr hanno permesso di rilevare delle variazioni nei livelli di espressione di RAG3, a seconda delle fonti di carbonio disponibili. Per quanto riguarda la regolazione ossigeno-dipendente, non sono ad oggi noti regolatori trascrizionali responsabili dell'induzione ipossica (o repressione da ossigeno) dell'espressione di KlPDC1. Al fine di identificare tali regolatori, si è proceduto seguendo, in parallelo, due diversi approcci: il primo ha previsto l'identificazione di omologhi di sequenza aminoacidica di regolatori coinvolti nella risposta all'ossigeno in Saccharomyces cerevisiae. Sono stati scelti gli omologhi di Rox1 e Mot3, repressori di geni ipossici in condizioni normossiche, e l'omologo di Mga2, che induce l'espressione di geni ipossici in risposta alla diminuzione di ossigeno. Sono stati ottenuti in K. lactis mutanti delezione per ciascuno dei tre geni, in modo da poter studiare sia gli effetti di ciascuna delezione sulla crescita di K. lactis, sia l'eventuale coinvolgimento di KlRox1, KlMot3 o KlMga2 nella regolazione dell'espressione di PDC1. Il secondo approccio adottato ha previsto la costruzione di due ceppi di opposto mating type recanti la fusione tra il promotore di KlPDC1 e il gene reporter lacZ. Tali ceppi sono stati sottoposti a mutagenesi random ed in seguito a screening su piastra per identificare i mutanti dell'induzione ipossica (o della repressione da ossigeno); è stato così possibile isolare un mutante, denominato CSK-27, in cui non si ha un incremento dell’espressione di KlPDC1 in ipossia, mentre i livelli di espressione normossici di tale gene sono identici al ceppo selvatico. E’ stato verificato che la mutazione contenuta in CSK-27 è allelica al gene RAG4, che codifica per l’unico sensore del glucosio in K. lactis. Ad oggi, non vi sono dati in letteratura che documentino un coinvolgimento di Rag4 nella regolazione ossigeno-dipendente dell’espressione di KlPDC1.MIUR (Prin 2006