The NOX2-NOX4-metabolism axis, a new therapeutic approach against Chronic Myeloid Leukemia

[ES] La LMC es un trastorno mieloproliferativo clonal producido por la translocación t(9;22)(q34;q11), conocida como el cromosoma Filadelfia. Esta translocación conduce a la yuxtaposición de los genes c-ABL1 (del inglés Abelson Leukemia Virus) y BCR (del inglés Breakpoint Cluster Region), generando así el gen quimérico BCR-ABL1 que codifica una oncoproteína con actividad tirosina quinasa que recibe el mismo nombre. La adquisición de este gen de fusión ocurre en una sola célula madre hematopoyética multipotente llamada célula madre de leucemia (LSC, del inglés Leukemic Stem Cells), que aún no está comprometida con la diferenciación mieloide o linfoide. De este modo BCR-ABL1 le aporta a esta célula una ventaja proliferativa y una capacidad de diferenciación aberrante responsables de la expansión de progenitores mieloides en la médula ósea. Si bien la sola presencia de BCR-ABL es suficiente para desencadenar la LMC, a medida que la enfermedad progresa aparecen nuevas alteraciones que modifican el comportamiento de las células leucémicas, reducen la sensibilidad a los tratamientos y favorecen aún más el avance a estados más similares a una leucemia mieloide aguda. Con la salida al mercado a principios de los años 2000 de los inhibidores tirosina quinasa (TKI) específicos contra BCR-ABL, el pronóstico de la LMC sufrió una revolución, pasando de ser una enfermedad de resultado fatal a una de pronóstico favorable. Aunque en gran parte de los pacientes el tratamiento continuado con TKI logra controlar la progresión de la enfermedad, la resistencia primaria o secundaria a estos tratamientos sigue suponiendo una grave amenaza, lo que justifica la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas. BCR-ABL presenta actividad tirosina quinasa constitutiva, activando una plétora de vías de señalización como PI3K/AKT, MAPKs o STAT5 que son responsables del fenotipo proliferador, antiapoptótico y del bloqueo de la diferenciación característico de las células tumorales. Pero, además, BCR-ABL induce cambios en dos importantes características distintivas de las células leucémicas: produce un incremento de ROS (del inglés Reactive Oxygen Species) celulares y modifica las necesidades y dependencias metabólicas. Las ROS colaboran en el control de varías de las rutas de señalización controladas por BCR-ABL, y favorecen la aparición de mutaciones puntuales y ruptura de doble cadena por su gran poder oxidante. Una de la fuentes más fuertemente implicadas en la elevación de los niveles de ROS en LMC es la familia de enzimas NADPH oxidasas, cuya única función conocida hasta el momento es precisamente la de producir ROS. Esta familia de enzimas transmembrana se comprende de 7 miembros: NOX1-4, que son dependientes de la subunidad estabilizadora p22phox; y NOX5, DUOX1 y DUOX2 cuya actividad está regulada por calcio. La expresión de BCR-ABL induce la glucólisis aerobia, fenómeno conocido como efecto Warburg, al incrementar la entrada y metabolismo de la glucosa en detrimento de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) mitocondria, y su gran capacidad para generar energía. Pero este viraje metabólico hacia la glucólisis parece no tener lugar en las LSC donde la glucosa captada se destina al OXPHOS mitocondrial, entre otros factores por su menor dependencia de BCR-ABL para sobrevivir. Tanto la sobreproducción de ROS como los cambios metabólicos descritos se han relacionado con la resistencia y progresión de la LMC a etapas más agresivas de la enfermedad. Las ROS son capaces de modular el metabolismo celular al afectar directa o indirectamente a reguladores maestros del metabolismo como la AMPK o HIF1; así como gracias a su capacidad para oxidar directamente a enzimas metabólicas como la GAPDH, la PKM2 o la PDH. Así en esta tesis nos planteamos investigar el papel que podrían estar cumpliendo las ROS producidas vía NADPH oxidasas sobre la particular adaptación metabólica de las células de LMC. Así, decidimos silenciar el homólogo NOX2, el más fuertemente relacionado con las células hematopoyéticas, así como la subunidad estabilizadora p22phox, esencial para el funcionamiento de NOX1-NOX4 y encontramos que las células NOX2 silenciadas, pero no las p22phox silenciadas indujeron el flujo de glucosa a través de la glucólisis y la entrada de piruvato a la mitocondria en células K562 mediante el estudio del destino metabólico de la glucosa con 13C6-glucosa. Además, encontramos que el silenciamiento de NOX2 aumenta el OXPHOS mitocondrial y la producción de ROS mitocondriales. Este efecto estuvo acompañado de una reducción en la ruta de señalización PI3K/AKT/mTOR y una activación de GSK3β que puede ser responsable de algunas de las adaptaciones metabólicas descritas. El hecho de encontrar que el silenciamiento de NOX2, pero no el de p22phox inducía cambios metabólicos, nos llevó a plantear que, además de NOX2, otro miembro de la familia dependiente de p22phox estuviese implicado en la regulación del metabolismo de la LMC. Encontramos que silenciamiento de NOX2 incrementó los niveles de ARN mensajero de NOX4 y la expresión proteica de p22phox en células enteras y en extractos enriquecidos en mitocondrias. NOX4 es el homólogo de la familia más fuertemente relacionado con la mitocondria, existiendo diversos artículos que localizan a esta proteína en la mitocondria o en las uniones retículo endoplásmico (RE)-mitocondria, donde se le ha asignado una función en la regulación metabólica mitocondrial. Siguiendo esta idea, el análisis metabólico y transcriptómico avaló la existencia de un eje NOX2-NOX4-mitocondria, observando que el silenciamiento de NOX4 evita el incremento en el OXPHOS provocado por el silenciamiento de NOX2 y el enriquecimiento de vías relacionadas con el metabolismo. Por último, evaluamos el potencial terapéutico de la inhibición de las NADPH oxidasas junto con el inhibidor de la hexoquinasa, 2DG; el inhibidor de la lactato deshidrogenasa, oxamato; o con el inhibidor de la piruvato deshidrogenasa quinasa, el DCA. Encontramos que la inhibición química de las NOX presentó un fuerte efecto sinérgico con los inhibidores del metabolismo 2DG, DCA y oxamato en líneas celulares y muestras de pacientes de LMC, además de ser igualmente eficaz en el tratamiento de células resistentes a los TKI. Por último, la inhibición específica de NOX2 con GSK2795039 junto con el DCA redujo de manera sinérgica la proliferación y capacidad clonogénica tanto en líneas celulares como en muestras de pacientes de LMC. Todos estos datos en conjunto muestran la existencia de un eje funcional NOX2-NOX4-metabolismo en LMC con un importante potencial terapéutico para el tratamiento de esta leucemia. [EN] Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative neoplasia induced by the t(9;22)(q34;q11) translocation, also known as the Philadelphia chromosome. Such translocation leads to the juxtaposition of the c-ABL1 (Abelson Leukemia Virus) and BCR (Breakpoint Cluster Region) genes, generating the BCR-ABL1 chimeric gene that encodes an oncoprotein with the same name, that shows constitutive tyrosine kinase activity. The acquisition of this genetic fusion occurs in a single stem cell or leukemic stem cell (LSC), which is not yet compromised either to myeloid or lymphoid lineages. BCR-ABL1 provides proliferation advantage and triggers an aberrant myeloid differentiation, which eventually leads to the expansion of myeloid progenitors in the bone marrow. Although the mere presence of BCR-ABL1 seems sufficient to induce the disease, as the disease progresses, new genetic alterations appear that modify the behaviour of the leukemic cells, reduce treatment sensitivity, and further favour progression to disease phases that remember an acute leukaemia. The widespread use of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) against BCR-ABL1 from the beginning of this century revolutionised CML treatment, the prognosis moved from dismal to very favourable. Although most patients respond well to prolonged TKI treatment, primary and secondary resistances are still a great threat, what justifies the search for novel therapeutic options. The constitutive activity of BCR-ABL is responsible of the activation of a plethora of signalling pathways such PI3K/AKT, MAPKs or STAT5, leading to the uncontrolled proliferation, apoptosis evasion and differentiation block that characterise CML cells. Moreover, BCR-ABL induces two important and distinctive features of leukemic cells: an enhanced production of Reactive Oxygen Species (ROS), and the alteration of metabolism. ROS are important for the maintenance of BCR-ABL induced signalling pathways, and they can induce oxidative damage leading to an enhanced rate of mutations and the appearance of DNA double strand breaks. One of the most prominent source of ROS in CML is the NADPH oxidase family. This family of enzymes is specialized in the production of ROS, which is its only known function; there are 7 members: NOX1-4, whose stability depend on the small transmembrane proteinp22phox; and NOX5, DUOX1 y DUOX2, whose activity is regulated by calcium. BCR-ABL expression induces an aerobic glycolysis, a phenomenon known as the Warburg effect, characterised by an enhanced oxidation of glucose through glycolytic pathway to the detriment of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS). However, this metabolic rewiring apparently does not occur in LSC; these cells rely metabolically on OXPHOS, and show a lower dependence on BCR-ABL for survival. Both, the overproduction of ROS and the metabolic rewiring, have been related with the appearance of resistances and disease progression to more aggressive stages. ROS can modify cellular metabolism due to their capacity of control of master regulators of metabolism such AMPK or HIF by direct or indirect mechanisms. Moreover, ROS can induce the oxidation of metabolic enzymes such GAPDH, PKM2 or PDH. Bearing the foregoing in mind, in this Thesis we aimed to investigate the role in CML metabolism of NADPH oxidase produced ROS. For this purpose, we decided to silence the expression of NOX2, the isoform most tightly related with haematopoietic cells, and the stabilising subunit p22phox, which is essential for the activity of for different complexes (NOX1-NOX4). By following the metabolic destiny of 13C6-glucose, we found that NOX2 silenced cells, unlike to p22phox silenced cells, enhanced the use of glucose through the glycolytic pathway, and the entry of pyruvate in the mitochondria. Besides, we also found that NOX2 silencing enhanced OXPHOS and the production of mitochondrial ROS, accompanied by the attenuation of the PI3K/AKT/mTOR pathway, and the activation of GSK3β, which may be responsible of some of the metabolic changes found. Considering that most of the metabolic changes observed in NOX2 silenced cells were not shared by p22phox silenced cells, we wondered whether another p22phox–dependent NOX, different from NOX2, was involved in the regulation of CML metabolism. We found that NOX4 mRNA levels were increased upon NOX2 silencing. At the same time, we also detected an increase of p22phox protein levels, both in whole cell extracts and in mitochondrial enriched fractions. Previous reports support a tight relation of NOX4 with the mitochondria. It has been reported the location of NOX4 in the mitochondria and in the mitochondria-ER contact sites (MERC); and the importance of this enzyme in the regulation of mitochondrial function is supported by the scientific evidence. In the same line, our metabolic and transcriptomic analyses support the existence of a NOX2-NOX4-mitochondria functional axis in CML cells, because NOX4 silencing prevent the enhancement in OXPHOS, and the enrichment of metabolism related pathways observed upon NOX2 silencing. Finally, we analysed the therapeutic potential of the simultaneous inhibition of NADPH oxidases and three different metabolism enzymes. Chemical inhibition of NADPH oxidases showed a synergistic effect upon combination with inhibitors for hexokinase (2DG), lactate dehydrogenase (oxamate), and pyruvate dehydrogenase kinase (DCA), both in CML cell lines and in patient cell samples. Such combinations showed also to be effective in TKI resistant cell lines. Finally, NOX2 specific inhibition with GSK2795039 plus DCA reduced synergistically cell proliferation and clonogenic capacity of CML cell lines and patient cell samples. In summary, our results support the existence of a functional axis NOX2-NOX4-mitochondria important for the regulation of CML metabolism and with a high therapeutic potential for the treatment of this leukaemia