Repositioning the Anti-Leprosy Drug Clofazimine Against Wnt-Dependent Cancers

In humans, Wnt signaling plays important roles in aspects of embryonic development. In adult tissues, Wnt signaling is tightly regulated to maintain stem cell niche homeostasis and tissue regeneration. Some cancers hijack the Wnt signaling pathway to promote different aspects of tumourigenesis, including colorectal, ovarian, breast cancer, hepatocellular carcinoma, glioblastoma etc. Despite the efforts made to find inhibitors of Wnt signaling, only a few have reached clinical trials and many exert toxicity. Drug repositioning is an attractive strategy to identify new uses for already approved drugs. Research in Prof Katanaev’s lab was the first to identify an anti-leprotic drug clofazimine (CFZ) as a promising Wnt signaling inhibitor in triple-negative breast cancer (TNBC). TNBC is a particularly aggressive subtype of breast cancer without targeted therapies. This thesis is part of the CFZ project to explore its potential as a Wnt signaling inhibitor, with the aim of potentially repositioning it as a targeted therapy against the broad range of Wnt-dependent cancers. Our preclinical studies have shown that CFZ specifically inhibits canonical Wnt signaling in vitro and in vivo. In mouse TNBC models, CFZ demonstrated an additive combination effect with the chemotherapeutic agent doxorubicin, without additional toxicity. Further in vitro studies in a panel of cancer cell lines demonstrated that CFZ has the potential to be repositioned against a broad range of Wnt-dependent cancers. We observed that the anti-proliferative efficacy of CFZ in a given cell line correlated with the basal level of Wnt signaling activation and the degree of Wnt inhibition produced by CFZ. By optimizing the structure of CFZ, we identified several highly water-soluble CFZ derivatives with improved Wnt inhibition without worsening aspecific cytotoxicity. The derivative MU17 demonstrated on-target tumour growth suppression in mouse model of TNBC. Importantly, MU17 ameliorated the skin discolouration side effect of CFZ. Despite its long history of clinical use, the mechanism of action of CFZ is still inconclusive. In addition, the newly discovered anti-Wnt properties of CFZ strongly suggest a novel and unexpected target. In this thesis, I have also attempted to identify the target(s) of CFZ within the Wnt signaling pathway. Using a pull-down assay followed by proteomic analysis, I have narrowed down a list of fifteen putative CFZ interacting proteins as potential target(s). However, further work is needed to verify the target of CFZ. The results of this thesis have a high potential for subsequent clinical impact. Our preclinical data suggest that CFZ is suitable and effective in a combination treatment with chemotherapy and is ready to be tested in clinical trials in TNBC patients. The in vitro efficacy of CFZ against a broad range of Wnt-dependent cancers opens up a new area of research for repositioning CFZ to other cancers beyond TNBC. With the prospect of identifying CFZ’s target within the Wnt signaling pathway and describing its Wnt inhibitory mechanism of action, we hope to provide valuable insights into the design of new Wnt inhibitors for cancer drug development. Chez l'homme, la signalisation Wnt joue un rôle important dans le développement embryonnaire. Dans les tissus adultes, la signalisation Wnt est étroitement régulée pour maintenir l'homéostasie des cellules souches et la régénération des tissus. Certains cancers détournent la voie de signalisation Wnt pour promouvoir la tumorogenèse. Malgré les efforts déployés pour trouver des inhibiteurs de la signalisation Wnt, seuls quelques-uns ont atteint l'étape des essais cliniques. Le repositionnement des médicaments est considéré comme une stratégie intéressante. Les recherches menées dans le laboratoire du professeur Katanaev ont été les premières à identifier un composé antiléprotique, la clofazimine (CFZ), comme un inhibiteur potentiel de la signalisation Wnt dans le cancer du sein triple négatif (TNBC). Le TNBC est un sous-type de cancer du sein particulièrement agressif qui manque de thérapies ciblées. Cette thèse fait partie du projet qui explore le potentiel de la CFZ en tant qu'inhibiteur de la voie de signalisation Wnt, dans le but de le repositionner potentiellement comme une thérapie ciblée contre la large gamme de cancers dépendants de cette voie. Nous avons mené des études précliniques en utilisant la CFZ dans des modèles de TNBC. Nous avons montré que la CFZ est un inhibiteur spécifique de la signalisation Wnt canonique in vitro et in vivo. La CFZ s'est avérée compatible avec l'agent chimiothérapeutique, montrant un effet additif sans toxicité supplémentaire. D'autres études in vitro sur un panel de lignées de cellules cancéreuses ont démontré que la CFZ a le potentiel d'être repositionnée contre une large gamme de cancers dépendants de Wnt. En optimisant la structure de la CFZ pour améliorer sa solubilité intrinsèque, nous avons identifié plusieurs dérivés de la CFZ présentant une meilleure inhibition de Wnt sans empirer la cytotoxicité aspécifique. Le dérivé MU17 a démontré une amélioration de l'effet secondaire sur la décoloration de la peau observé avec la CFZ. Malgré une longue histoire d'utilisation en clinique, le mécanisme d'action de la CFZ n'est toujours élucidé. Ce travail de thèse a également servi à tenter d’identifier la ou les cibles de la CFZ dans la voie de signalisation Wnt. L’analyse des protéines associées à la CFZ m’a permis d’établir une liste de quinze protéines, ayant une interaction possible avec la CFZ, à évaluer comme cible(s) potentielle(s). Cependant, des travaux supplémentaires sont nécessaires pour valider la cible de la CFZ. Cette recherche peut avoir un impact clinique potentiel élevé. Nos données précliniques suggèrent que la CFZ peut être utilisé dans un futur essai clinique comme le cadre d'un traitement combiné pour les patientes atteintes du TNBC. L'efficacité in vitro de la CFZ dans un large éventail de cancers dépendant de Wnt ouvre un nouveau champ de recherche pour repositionner la CFZ dans d'autres cancers. En identifiant la cible de la CFZ et en décrivant son mécanisme d'action pour inhiber la voie Wnt, nous espérons fournir de nouvelles perspectives dans la conception de nouveaux inhibiteurs de Wnt pour le développement de médicaments contre le cancer.