Funktion des C-terminalen Tryptophans cytosolischer Eisen-Schwefel-Proteine bei deren Assemblierung

Eisen-Schwefel (Fe/S)-Cluster sind als essentielle Cofaktoren zahlreicher Proteine in allen Domänen des Lebens vertreten. In eukaryotischen Zellen sind ca. 50 cytosolische und nucleäre Fe/S-Proteine an lebenswichtigen Prozessen, wie der DNA-Replikation und Reparatur, Transkription, tRNA-Modifizierung, Ribosomenassemblierung und metabolischen Stoffwechselwegen, beteiligt. Die Biosynthese und die Insertion der Fe/S-Cluster in Apoproteine erfolgt durch die cytosolische Eisen-Schwefel-Protein-Assemblierungs-maschinerie (CIA). Daran sind nach aktuellem Kenntnisstand elf Faktoren beteiligt. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind auf molekularer Ebene jedoch noch nicht aufgeklärt. So ist die Erkennung der Apoproteine durch den CIA-Targeting-Komplex bisher nahezu unerforscht. Molekulare Erkennungsfaktoren, eingebettet in der Primärsequenz der cytosolischen und nucleären Targetproteine, wurden bisher nicht beschrieben. In bioinformatischen Analysen wurde das Tripeptid L(D/E)W am C-Terminus von cytosolischen und nucleären Fe/S-Proteinen identifiziert. Vor allem der Tryptophanrest ist auffällig hoch konserviert. Auf Grund des geringen Vorkommens dieser Aminosäure im eukaryotischen Proteom ist dieses frequente Auftreten von Interesse. Zunächst wurde der Einfluss des C-terminalen Tripeptides auf den Einbau des Fe/S-Clusters in die cytosolischen Apoproteine Leu1, Nar1 und Apd1 im Modellorganismus S. cerevisiae untersucht. C-terminal gekürzte bzw. mutierte Proteinvarianten zeigen in Enzymaktivitätsmessungen, 55Fe-Einbau-Experimenten und Wachstumsuntersuchungen einen Defekt im Clustereinbau. Im Gegensatz dazu hat das Tryptophan bei der Reifung der Isopropylmalat-Isomerase (IPMI, Leu1) in E. coli bzw. bei der chemischen Rekonstitution gereinigter Proteine keine Bedeutung, sodass eine Verbindung des Peptidmotives zur CIA-Maschinerie postuliert wird. Im zweiten Teil wurden Interaktionsstudien zwischen Targetproteinen bzw. Peptiden und den Proteinen des CIA-Targeting-Kompexes Cia1, Cia2 und Met18 durchgeführt. Als in vivo Verfahren wurden das Y2H- bzw. Y3H-System sowie die BioID angewendet. Neben Coimmunpräzipitation wurden auch Peptid-basierte in vitro Methoden wie Fluoreszenzanisotropie-Messungen, ITC und chemische Quervernetzung analysiert. Durch Depletionsstudien konnte gezeigt werden, dass das C-terminale Tryptophan insbesondere bei niedriger Cia1-Konzentration essentiell ist. Im dritten Teil war es möglich, die E. coli-IPMI durch Fusion mit der C-terminalen Sequenz der Hefe-IPMI im Hefecytosol funktionell zu exprimieren. Dieser Funktionstransfer ist abhängig von der CIA-Maschinerie. Dies ist von Bedeutung für die biotechnologische Anwendung von prokaryotischen Fe/S-Proteinen im Cytosol eukaryotischer Organismen. Diese Arbeit liefert, durch die Identifizierung des C-terminalen Tryptophans als Signalsequenz cytosolischer und nucleärer Fe/S-Proteine, einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der Erkennung der Targetproteine durch die CIA-Maschinerie