Novel mechanisms of pathologic calcification in the musculoskeletal system

La calcification pathologique (CP) du système musculo-squelettique se définit par la déposition de cristaux calciques dans des tissus qui normalement ne se calcifient pas, comme les cartilages articulaires et les tendons. Cela conduit au développement de deux maladies fréquentes appelées respectivement ostéoarthrose (OA) et tendinopathie calcifiante d'Achille (TC). Les facteur de risques vont de la vieillesse aux traumatismes, en passant par les contraintes mécaniques, les interventions chirurgicales, etc. Plusieurs mécanismes sont activés durant ce processus : la de-différenciation des cellules non calcifiantes du cartilage (chondrocytes) et du tendon (ténocytes) en cellules pro-calcifiantes, augmentation de l'expression des transporteurs et des enzymes impliqués dans le processus de calcification, libération de médiateurs inflammatoires, hausse / augmentation de la mortalité cellulaire et production de stress oxydatif. Les cristaux contenant du calcium qui en résultent peuvent déclencher l'amplification de ces mécanismes et ainsi induire davantage la production d’enzymes de dégradation de la matrice. Il en résulte une dégradation du cartilage dans l'OA et un taux accru de rupture des tendons dans la TC, entraînant des douleurs et un handicap. Dans cette thèse, nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme dans l'OA dans lequel la lysyl oxydase (LOX), catalysant physiologiquement les liaisons transversales du collagène dans l’os, est associée à la CP. En condition calcifiante, l'expression de LOX est augmentée dans le cartilage de genou humain et murin et son activité est induite dans les chondrocytes primaires murins. Par ailleurs, son inhibiteur BAPN a aboli le dépôt de cristaux de calcium in vitro. Cela révèle que l’augmentation des liaisons transversales du collagène est médiée par LOX, mais également par la réduction des marqueurs moléculaires de calcification et d'hypertrophie (Anx5, Pc1, Pit1, Pit2, Runx2 et Col10), la diminution de la production d'interleukine-6 (IL-6), ainsi que la libération d'espèces réactives de l'oxygène et d'enzymes dégradant le cartilage (Mmp3, Mmp13, Adamts5). Récemment, notre laboratoire a identifié le gazotransmetteur sulfure d'hydrogène (H2S) comme étant un anti-calcifiant efficace dans l'ostéoarthrose. Dans la deuxième partie de la thèse, nous avons donc étudié son rôle dans le TC,. Nous avons révélé que la production endogène (par l’enzyme CSE) et l'ajout exogène de H2S sont protecteurs contre la CP dans les ténocytes in vitro. Outre ses effets cytoprotecteurs et anti-inflammatoires, le H2S est capable d'inhiber l'expression et l'activité de LOX dans les ténocytes. De plus, l'expression de CSE est inversement corrélée à l'expression de LOX ainsi que de la CP dans les modèles murins et patients atteints de TC. Pour finir, nous avons démontré pour la première fois un lien de protection contre la CP du cartilage par la sous unité d’intégrine CD11b. En effet, les chondrocytes murins primaires CD11b KO ont un phénotype pro-calcifiant par rapport aux sauvages. Ces résultats sont confirmés par une augmentation de l'activité de la phosphatase alcaline et de la sécrétion de IL-6. De plus, la microscopie électronique à émission a révélé dans le cartilage articulaire des souris CD11b KO une augmentation des nodules de calcification ainsi qu’une libération de vésicules matriculaires abondante, accompagnée d'une augmentation de l'apoptose. Bien que l'absence de CD11b n'ait pas modifié la teneur globale de collagène présent dans la matrice extracellulaire (MEC), elle est en revanche associée à une augmentation des liaisons transversales du collagène. De manière intéressante, la perte fonctionnelle de CD11b augmente également l'expression et l'activité de LOX dans les tissus cartilagineux. Enfin, les souris CD11b KO ayant subi une ménisectomie présentent des lésions cartilagineuses plus importantes et une légère calcification. Ces résultats révèlent le rôle protecteur de CD11b contre la CP et la dégénérescence du cartilage dans l'ostéoarthrose. Dans l'ensemble, nos résultats ont permis d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour l'ostéoarthrose et les tendinopathies calcifiantes. En effet, l'inhibition de LOX, l'activation de CD11b ou l'induction de H2S sont des stratégies à étudier pour le traitement de ces maladies invalidantes. Plus important encore, ces données pourraient impacter d’autres maladies associées à une CP, tels que les vaisseaux sanguins, la peau, ou encore les reins. -- Pathologic calcification (PC) of the musculoskeletal system is the deposition of calcium- containing crystals in tissues that normally do not calcify, such as articular cartilage and tendon. This leads to the development of two frequent human conditions called osteoarthritis (OA) and Achilles calcific tendinopathy (CT) respectively. Risk factors range from age to trauma, mechanical stress, surgery and others. PC results form the activation of different mechanims: de-differentiation of non-calcifying cartilage cells (chondrocytes) and tendon cells (tenocytes) into pro-calcifying, increased expression of transporters and enzymes involved in the calcification process, release of inflammatory mediators, cell death and oxydative stress. The resulting crystals can trigger amplification of these mechanisms and additionaly induce matrix-degrading enzymes. Overall, this bings cartilage degradation in OA and increased tendon rupture rate in CT, with subsequent pain and disability. First, we elucidated a novel mechanism where lysyl oxidase (LOX), the enzyme that catalyzes collagen-crosslinks, is associated with PC in OA. Indeed, LOX expression was increased in murine and human calcifying cartilage and its activity was induced in primary murine chondrocytes treated with calcification stimuli in vitro. Conversly, the LOX inhibitor BAPN abrogated calcium-crystal deposition. This was accounted for by inhibition of LOX- mediated collagen cross-links, downregulation of calcification and hypertrophy markers (Anx5, Pc1, Pit1, Pit2, Runx2 and Col10), as well as diminished interleukin-6 (IL-6) production, reactive oxigen species release, and cartilage degrading enzymes (Mmp3, Mmp13, Adamts5). Recently, our labouratory identified the gasotransmitter hydrogen sulfide (H2S) as an efficient anti-calcification agent in OA. In the second part of the thesis, we investigated its role in CT. We showed that endogenously produced (CSE enzyme) and exogenous addition of H2S is protective against tenocytes calcification in vitro. Next, we revelad that, in addition to cytoprotective and anti-inflammatory effects, H2S was also able to inhibit LOX expression and activity in tenocytes. Accordingly, CSE expression inversely correlated with LOX expression and calcification in murine models of CT, and in human tendons from CT patients. Next, in a published study, we demonstrated for the first time that the CD11b integrin subunit plays a role in cartilage PC. Here, we could show that primary murine CD11b KO chondrocytes have a pro-calcifying phenotype compared to WT, as measured by Alizarin red staining, Alkaline phosphatase (Alp) activity, and the secretion of the pro-calcification cytokine IL-6. Furthermore, analysis of naïve CD11b KO articular cartilage by trasmission electron microscopy revealed increased calcification nodules and abundant matrix vesicles release, with more apoptotic chondrocytes than in WT cartilage. Given the importance of integrins in mediating ECM-cell crosstalk, we also investigated whether CD11b deficiency could impact on this ECM changes involved in PC. We showed that, although lack of CD11b did not cause a change in overall ECM collagen content, it associated with smaller collagen fibers and increased collagen cross-links. Indeed, LOX expression and activity was augmented in CD11b KO cartilage compared to WT cartilage. Finally, in the in vivo meniscectomy model of murine OA, CD11b deficient mice exhibited increased cartilage damage and a trend towards increased calcification. These results demonstrate that CD11b plays a protective role against cartilage PC and degeneration in OA. Overall, the results of this thesis allowed the identification of new possible therapeutic target for OA and CT. In particular, inhibition of LOX, activation of CD11b or induction of the H2S pathway can all represent potential strategies to treat these disabling conditions. Most importantly, these findings could have a broader impact for additional PC diseases affecting other tissues (vessels, skins, kidney, etc)