Impact of photophysics and photochemistry of cyanine dyes on localization microscopy

In den letzten Jahren haben sich hochauflösende Fluoreszenzmikroskopiemethoden, basierend auf der Lokalisation einzelner Fluorophore, zu einem leistungsstarken Werkzeug etabliert, um Fluoreszenzbilder weit unterhalb der Auflösungsgrenze zu generieren. Hiermit können räumliche Auflösungen von ~ 20 nm erzielt werden, was weit unterhalb der Beugungsgrenze liegt. Dabei haben zahlreiche Optimierungen und Entwicklungen neuer Methoden in der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie die Genauigkeit der orstspezifischen Bestimmung einzelner Fluorophore auf bis zu ~ 1 – 3 nm erhöht. Eine Auflösung im molekularen Bereich, weit unterhalb von ~ 10 nm bleibt allerdings herausfordernd, da die Lokalisationsgenauigkeit nur ein Kriterium hierfür ist. Allerdings wurde sich in den letzten Jahren überwiegend auf die Verbesserung dieses Parameters konzentriert. Weitere Kriterien für die fluoreszenzmikroskopische Auflösung sind dabei unter anderem die Markierungsdichte und die Kopplungseffizienz der Zielstruktur, sowie der Kopplungsfehler (Abstand zur Zielstruktur nach Farbstoffkopplung), die sich herausfordernd für eine molekulare Auflösung darstellen. Auch wenn die Kopplungseffizienz und -dichte hoch und der Kopplungsfehler gering ist, steigt bei Interfluorophordistanzen < 5nm, abhängig von den Farbstoffen, die Wahrscheinlichkeit von starken und schwachen Farbstoffwechselwirkungen und damit von Energieübertragungsprozessen zwischen den Farbstoffen, stark an. Daneben sollten Farbstoffe, abhänging von der Lokalisationsmikroskopiemethode, spezifische Kriterien, wie beispielsweise die Photoschaltbarkeit bei dSTORM, erfüllen, was dazu führt, dass diese Methoden häufig nur auf einzelne Farbstoffe beschränkt sind. In dieser Arbeit konnte mithilfe von definierten DNA-Origami Konstrukten gezeigt werden, dass das Blinkverhalten von Cyaninfarbstoffen unter dSTORM-Bedingungen einer Abstandsabhängigkeit aufgrund von spezifischen Energieübertragungsprozessen folgt, womit Farbstoffabstände im sub-10 nm Bereich charakterisiert werden konnten. Darüber hinaus konnte diese Abstandsabhängigkeit an biologischen Proben gezeigt werden. Hierbei konnten verschiedene zelluläre Rezeptoren effizient und mit geringem Abstandsfehler zur Zielstruktur mit Cyaninfarbstoffen gekoppelt werden. Diese abstandsabhänigen Prozesse und damit Charakterisierungen könnten dabei nicht nur spezifisch für die häufig unter dSTORM-Bedingungen verwendeten Cyaninfarbstoffen gültig sein, sondern auch auf andere Farbstoffklassen, die einen Auszustand zeigen, übertragbar sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass hochauflösende dSTORM Aufnahmen unabhängig vom Farbstoffkopplungsgrad der Antikörpern sind, welche häufig für Standardfärbungen von zellulären Strukturen verwendet werden. Dabei konnte durch Photonenkoinzidenzmessungen dargelegt werden, dass aufgrund komplexer Farbstoffwechselwirkungen im Mittel nur ein Farbstoff aktiv ist, wobei höhere Kopplungsgrade ein komplexes Blinkverhalten zu Beginn der Messung zeigen. Durch die undefinierten Farbstoffabstände an Antikörpern konnte hier kein eindeutiger Energieübertragungsmechanismus entschlüsselt werden. Dennoch konnte gezeigt werden, dass Farbstoffaggregate bzw. H-Dimere unter dSTORM-Bedingungen destabilisiert werden. Durch die zuvor erwähnten DNA-Origami Konstrukte definierter Interfluorophordistanzen konnten Energieübertragungsmechanismen entschlüsselt werden, die auch für die Antikörper diverser Kopplungsgrade gültig sind. Des Weiteren konnten, ausgelöst durch komplexe Energieübertragungsprozesse höherer Kopplungsgrade am Antikörper, Mehrfarbenaufnahmen zellulärer Strukturen generiert werden, die über die spezifische Fluoreszenzlebenszeit separiert werden konnten. Dies stellt hier eine weitere Möglichkeit dar, unter einfachen Bedingungen, schnelle Mehrfarbenaufnahmen zellulärer Strukturen zu generieren. Durch die Verwendung des selben Farbstoffes unterschiedlicher Kopplungsgrade kann hier nur mit einer Anregungswellenlänge und frei von chromatischer Aberration gearbeitet werden. Neben den photophysikalischen Untersuchungen der Cyaninfarbstoffe Cy5 und Alexa Fluor 647 wurden diese ebenso photochemisch näher betrachtet. Dabei konnte ein neuartiger chemischer Mechanismus entschlüsselt werden. Dieser Mechanismus führt, ausgelöst durch Singulett-Sauerstoff (1O2), zu einer Photozerschneidung des konjugierten Doppelbindungssystems um zwei Kohlenstoffatome, was zu strukturellen und spektroskopischen Veränderungen dieser Farbstoffe führt. Auf Grundlage dieses Mechanismus konnte eine neue DNA-PAINT Methode entwickelt werden, die zu einer Beschleunigung der Aufnahmezeit führt.In recent years, high-resolution fluorescence microscopy methods based on the localization of individual fluorophores have become a powerful tool for generating fluorescence images below the diffraction limit. This means that spatial resolutions of ~ 20 nm can now be achieved, which are far below the diffraction limit. Numerous optimizations and developments of new methods in single molecule localization microscopy have increased the localization precision up to ~ 1 - 3 nm. However, a spatial resolution in the molecular range, far below ~ 10 nm, remains challenging, because the localization precision is only one criterion for achieving molecular resolution. However, in recent years the main focus has been on improving this parameter. Additional challenging criteria for achieving molecular resolution include the coupling density and the coupling efficiency of the target structure, as well as the linkage error (distance to the target structure after dye coupling). Even if a high coupling density and coupling efficiency, as well as a low linkage error can be achieved, interfluorophore distances < 5 nm increase the probability of strong and weak dye interactions and thus energy transfer processes between the dyes strongly increase. In addition, depending on the localization microscopy method, dyes should fulfill specific criteria, such as photoswitchability for dSTORM, which means that these methods are often limited to a few dyes. In this work it could be shown with the help of defined DNA origami constructs that the blinking behavior of cyanine dyes follows a distance dependence under dSTORM conditions due to specific energy transfer processes. With this, dye distances in the sub-10 nm range could be characterized. In addition, this distance dependency could be shown on biological samples. Here, different cellular receptors could be efficiently labeled with Cy5 dyes at a low linkage error. These distance dependent processes and thus characterizations could not only be specifically valid for cyanine dyes that are frequently used under dSTORM conditions, but also be transferable to other classes of dyes that show a fluorescence off states. In addition, it could be shown that high resolution dSTORM images are independent of the degree of labeling of antibodies, which are often used for standard staining of cellular structures. It could be shown by photon antibunching measurements that, due to complex strong and weak dye interactions, only one dye is emitting on average, showing a complex blinking behavior at the beginning of the measurement with higher degrees of labeling. Due to the undefined distance between the dyes on antibodies, no clear energy transfer mechanism could be deciphered. Nevertheless, it could be shown that dye aggregates or H-dimers are destabilized under dSTORM conditions. The mentioned DNA origami constructs of defined interfluorophore distances made it possible to decipher energy transfer mechanisms that are also valid for antibodies of various degrees of labeling. Furthermore, triggered by complex energy transfer processes at higher degree of labeling on the antibody, multicolor images of cellular structures could be generated, which could be separated over the specific fluorescence lifetime. This represents a further possibility to generate fast multicolor images of cellular structures at simple buffer conditions. Here, by using the same dyes at different degrees of labeling, it is possible to work with only one excitation wavelength and free of chromatic aberration. In addition to the photophysical investigations of the cyanine dyes Cy5 and Alexa Fluor 647, the photochemical behaviour of these dyes was also examined more closely. Here, a novel chemical mechanism could be deciphered. This mechanism, triggered by singlet oxygen (1O2), leads to a phototruncation of the conjugated double bond system by two carbon atoms resulting in structural and spectroscopic changes of this dye. On the basis of this mechanism, a new DNA-PAINT method could be developed, leading to faster recording times