Structural basis studies of Ubiquitin/SUMO-related protease activity

Les modificacions de proteïnes post-traduccionals per ubiquitina i SUMO regulen moltes vies principals a la cèl·lula. Aquestes modificacions es poden revertir mitjançant enzims deubiquitinants com les proteases específiques de la ubiquitina (USP) o les deSUMOilasees com les proteases específiques de SUMO (SENP). L'activitat proteolítica cap a substrats modificats amb ubiquitina és comuna a tots els membres de la família USP excepte USPL1, que mostra una preferència única per SUMO. En humans, l'activitat desSUMOilant la duu a terme principalment la família de proteases SENP/ULP, que està constituïda per sis membres que comparteixen un domini globular catalític homòleg. SENP6 i SENP7 són els membres més divergents de la família i mostren una preferència d'isoformes SUMO2/3 i una activitat particular per desmuntar cadenes polySUMO2. NopD, una proteïna efectora del sistema de secreció tipus III (T3SS) de Bradyrhizobium, és un enzim polivalent amb especificitat per a substrats de SUMO i ubiquitina vegetal. En la present tesi, primer presentem l'estructura cristal·lina d'USPL1 unida a SUMO2. Trobem que USPL1 manca d'elements estructurals principals presents en tots els membres canònics d'USPs com els anomenats "Blocking Loops", que permeten la unió de SUMO enlloc de ubiquitina. En segon lloc, revelem l'estructura cristal·lina del domini catalític de SENP7 humà unit a SUMO2 i describim els contactes específics entre SUMO2 i una inserció única a SENP7 (anomenada Loop1) que és responsable de l'especificitat de la isoforma SUMO2. Finalment presentem les estructures cristal·lines de NopD lligades a At.SUMO2 i a ubiquitin, i revelem els detalls moleculars d'aquesta activitat dual de NopD per SUMO i ubiquitina. L'anàlisi de mutagènesi revela els determinants estructurals, com ara un "Loop" d'inserció únic a NopD, que són responsables de l'activitat dual inusual de NopD per a SUMO i ubiquitina. Tots els resultats desvelen els detalls estructurals de la interfície d'aquests complexos proteics i contribueixen a enriquir el coneixement de les diferents direccions evolutives seguides pels membres de les famílies deubiquitinants i deSUMOilants.Las modificaciones de proteínas postraduccionales por ubiquitina y SUMO regulan muchas vías importantes en la célula. Estas modificaciones se pueden revertir mediante enzimas deubiquitinantes como las proteasas específicas de ubiquitina (USP) o deSUMOylantes como las proteasas específicas de SUMO (SENP). La actividad proteolítica frente a los sustratos modificados con ubiquitina es común a todos los miembros de la familia USP excepto a USPL1, que muestra una preferencia única por SUMO. En humanos, la actividad de deSUMOilación la realiza principalmente la familia de proteasas SENP/ULP, que está constituida por seis miembros que comparten un dominio globular catalítico homólogo. SENP6 y SENP7 son los miembros más divergentes de la familia y muestran una preferencia de isoforma SUMO2/3 única y una actividad particular para desmantelar cadenas de poliSUMO2. NopD, un efector del sistema de secreción tipo III (T3SS) de Bradyrhizobium, es una enzima multipropósito con especificidad para sustratos de ubiquitina y SUMO vegetal. En la presente tesis, primero presentamos la estructura cristalina de USPL1 unido a SUMO2. Encontramos que USPL1 carece de los principales elementos estructurales presentes en todos los miembros canónicos de USP, como los llamados "Blocking Loops", que facilitan la unión de SUMO en vez de ubiquitina. En segundo lugar, revelamos la estructura cristalina del dominio catalítico de SENP7 humano unido a SUMO2 y describimos los contactos específicos entre SUMO2 y una inserción única en SENP7 (llamada Loop1) que es responsable de la especificidad de la isoforma SUMO2. Finalmente mostramos las estructuras cristalinas de NopD unidas a AtSUMO2 y a ubiquitina, y revelar los detalles moleculares de esta actividad dual de NopD para SUMO y ubiquitina. El análisis de mutagénesis desvela los determinantes, como un "Loop" de inserción único en NopD, que son responsables de esta actividad dual inusual de NopD para SUMO y ubiquitina. Todos los resultados dan una idea de los detalles estructurales de la interfaz de estos complejos de proteínas y contribuyen a enriquecer el conocimiento de las distintas direcciones evolutivas seguidas por los miembros de las familias deubiquitinantes y deSUMOylantes.Post-translational protein modifications by ubiquitin and SUMO regulate many major pathways in the cell. These modifications can be reversed by de-ubiquitinating enzymes such as ubiquitin-specific proteases (USPs) or deSUMOylaseas such as SUMO-specific proteases (SENPs). Proteolytic activity towards ubiquitin-modified substrates is common to all USP family members except for USPL1, which shows a unique preference for the small ubiquitin-like modifier SUMO. In humans, the deSUMOylating activity is mainly conducted by the SENP/ULP protease family, which is constituted of six members sharing a homologous catalytic globular domain. SENP6 and SENP7 are the most divergent members of the family and they show a unique SUMO2/3 isoform preference and a particular activity for dismantling polySUMO2 chains. NopD, an effector of the type III secretion system (T3SS) from Bradyrhizobium, is a multipurpose enzyme with specificity for ubiquitin and plant SUMO substrates. In the present thesis, we first present the crystal structure of USPL1 bound to SUMO2. We find that USPL1 lacks major structural elements present in all canonical USPs members such as the so-called blocking loops, which facilitate SUMO binding instead of ubiquitin. Second, we reveal the crystal structure of the catalytic domain of human SENP7 bound to SUMO2, and described the specific contacts between SUMO2 and a unique insertion in SENP7 (named Loop1) that is responsible for the SUMO2 isoform specificity. We finally present the crystal structures of NopD bound to AtSUMO2 and to ubiquitin, and reveal the molecular details for this dual activity of NopD for SUMO and ubiquitin. Mutagenesis analysis disclose the determinants, such as the unique insertion loop in NopD, that are responsible for unusual dual NopD activity for SUMO and ubiquitin. All results give insight into the structural details of these protein complexes' interface and contribute to enrich the knowledge of the distinct evolutionary directions followed by members of deubiquitinating and deSUMOylating families