Characteristics and Applications of the Anti-infective Activity of Eosinophil Derived RNases

En els darrers anys, els pèptids de defensa derivats de l'hoste estan destacant com a candidats prometedors per esdevenir nous agents antimicrobians. En el nostre laboratori, hem estat treballant amb les RNases derivades dels grànuls de l'eosinòfil; la neurotoxina derivada de l'eosinòfil (EDN/RNasa 2) i la proteïna catiònica de l'eosinòfil (ECP/RNasa 3), unes proteïnes del sistema immune innat que han demostrat tenir una activitat antimicrobiana d'ampli espectre. Després de diverses etapes d'optimització de fragment N-terminal de l'RNasa 3, que reté la major part de l'activitat antimicrobiana de la proteïna, els pèptids ECPep-D and ECP-2D-Orn han demostrat ser els més efectius contra bacteris in vitro. En base a aquests pèptids, vam establir un model d'infecció sistèmica en ratolins induït per A. baumannii per tal d'explorar-ne l'eficàcia in vivo. Primer vam demostrar que la toxicitat d'ambdós pèptids estava dins del rang normal en comparació amb altres pèptids antimicrobians. Els resultats també demostren que els ratolins tractats amb ECPep-D arriben a un 70% de ràtio de supervivència i l'alliberament de TNF-α es redueix en el grup tractat. Recentment hem dissenyat al nostre laboratori una proteïna quimèrica que hem anomenat RNasa 3/1 amb l'objectiu de mantenir l'alta activitat catalítica de la RNasa 1 i l'elevada activitat antibacteriana de la RNasa 3. Quan es combina amb colistina, la RNasa 3/1 pot inhibir significativament l'adquisició de resistència d'A. baumannii a la colistina. Com a fet destacable, veiem que els mutants no catalítics de la RNasa 3/1 no tenen capacitat d'inhibir l'adquisició de resistència en combinació amb la colistina. Aquests resultats demostren que el mecanisme d'inhibició de la resistència dependria de l'activitat ribonucleasa de la RNasa 3/1 combinada amb la capacitat de disrupció de la membrana de la colistina, la qual cosa esdevé una nova estratègia per lluitar contra la resistència bacteriana als antibiòtics. Referent a l' RNasa 2, s'ha reportat que la seva activitat catalítica és clau per la seva activitat antivírica. En aquesta tesi hem exposat macròfags THP-1 al virus respiratori sincitial (VRS) per tal d'explorar com la RNasa 2 afecta les cèl·lules exposades al virus. Hem trobat que el VRS pot activar l'expressió de la RNasa 2 en macròfags i que la seva presència redueix la càrrega viral. També hem trobat diferències significatives en diversos tRNAs en comparar les poblacions de ncRNA en cèl·lules de tipus salvatge i amb un knock-out de l'EDN. Finalment, hem confirmat en aquest model ex vivo que la RNasa 2 prefereix pirimidines a al seti d'unió de bases B1 i adenina a B2. A tall de conclusió, en aquesta tesi hem determinat l'activitat antibacteriana in vivo del pèptid ECPep-D, comparable a la d'altres pèptids antimicrobians. També hem elucidat la capacitat de la RNasa 3/1 de reduir l'adquisició de resistència d'A. baumannii a la colistina, la qual seria dependent de la seva activitat catalítica. Finalment, hem contribuït a definir el patró de tall de la RNasa 2 en tRNA. Tots aquests resultats ajudaran a avançar en la caracterització de les RNases antimicrobianes.En los últimos años, los péptidos de defensa derivades del huésped están destacando como candidatos prometedores para convertirse en nuevos agentes antimicrobianos. En nuestro laboratorio, hemos estado trabajando con las RNasas derivadas de los gránulos del eosinófilo; la neurotoxina derivada del eosinófilo (EDN/RNasa 2) y la proteína catiónica del eosinófilo (ECP/RNasa 3), unas proteínas del sistema inmune innato que han demostrado tener una actividad antimicrobiana de amplio espectro. Después de varias etapas de optimización del fragmento N-terminal de la RNasa 3, que retiene la mayor parte de la actividad antimicrobiana de la proteína, los péptidos ECPep-D y ECP-2D-Orn han demostrado ser los más efectivos contra bacterias in vitro. En base a estos péptidos, establecimos un modelo de infección sistémica en ratones inducido por A. baumannii para explorar su eficacia in vivo. Primero demostramos que la toxicidad de ambos péptidos estaba dentro del rango normal en comparación con otros péptidos antimicrobianos. Los resultados también demostraron que los ratones tratados con ECPep-D llegaron a un 70% de ratio de supervivencia y que la liberación de TNF-α se reduce en el grupo tratado. Recientemente hemos diseñado en nuestro laboratorio una proteína quimérica a la que hemos nombrado RNasa 3/1 con el objetivo de mantener la elevada actividad catalítica de la RNasa 1 i la alta actividad antibacteriana de la RNasa 3. Cuando se combina con colistina, la RNasa 3/1 puede inhibir significativamente la adquisición de resistencia de A. baumannii a la colistina. Como hecho destacable, vemos que los mutantes no catalíticos de la RNasa 3/1 no tienen la capacidad de inhibir la adquisición de resistencia en combinación con la colistina. Estos resultados demuestran que el mecanismo de inhibición de la resistencia dependería de la actividad ribonucleasa de la RNasa 3/1 combinada con la capacidad de disrupción de la membrana de la colistina, lo cual se convierte en una nueva estrategia para luchar contra la resistencia bacteriana a los antibióticos. Referente a la RNasa 2, se ha reportado que la actividad catalítica es clave para su actividad antivírica. En esta tesis hemos expuesto a macrófagos THP-1 al virus respiratorio sincitial (VRS) para explorar como la RNasa 2 afecta las células expuestas al virus. Hemos descubierto que el VRS puede activar la expresión de la RNasa 2 en macrófagos y que su presencia reduce la carga viral. También hemos descubierto diferencias significativas en diversos tRNAs en comparar las poblaciones de ncRNA en células de tipo salvaje y con un knock-out de la EDN. Finalmente, hemos confirmado en un modelo ex vivo que la RNasa 2 prefiere pirimidinas en el sitio de unión de bases B1 y adenina en B2. Como conclusión, en esta tesis hemos determinado la actividad antibacteriana in vivo del péptido ECPep-D, comparable con la de otros péptidos antimicrobianos. También hemos elucidado la capacidad de la RNasa 3/1 de reducir la adquisición de resistencia de A. baumannii a la colistina, la cual sería dependiente de su actividad catalítica. Finalmente, hemos contribuido a definir el patrón de corte de la RNasa 2 en tRNA. Todos estos resultados ayudarán a avanzar en la caracterización de las RNasas antimicrobianas.In the last years, host-derived defense peptides (HDPs) are emerging as promising candidates for new antimicrobial agents. In our laboratory, we have been working with eosinophil granules derived RNases, eosinophil-derived neurotoxin (EDN/RNase 2) and eosinophil cationic protein (ECP/RNase 3), proteins from the innate immune system that have been proven to show broad antimicrobial activities. After several optimization steps of the N-terminal fragment of RNase 3, which retains most of the antimicrobial activity of the protein, ECPep-D and ECP-2D-Orn peptides have been proven to be the most effective against bacteria in vitro. Afterwards, a murine systemic infection model induced by A. baumannii was used here to further explore the efficacy of these peptides in vivo. We have first demonstrated that the toxicity of both peptides is within the normal range in comparison to that of other AMPs. Results also highlight that mice treated with ECPep-D have reached a 70% of survival rate and the release of TNF-α is reduced in the treatment group. Recently, we have designed in our lab a protein chimera named RNase 3/1 with the goal to keep the enzymatic ability of RNase 1 and the high antibacterial activity of RNase 3. When combined with colistin, RNase 3/1 can significantly hinder the resistance acquisition of A. baumannii to colistin. Interestingly, when a non-catalytic mutant of RNase 3/1 was combined with colistin, there was no delay of the bacterial resistance acquisition. Overall, the results highlight that this mechanism relies on the ribonuclease activity of RNase 3/1 and the membrane disrupting ability of colistin, which provides a new strategy to fight against bacterial resistance. In case of RNase 2, its catalytic activity has also been reported to be crucial for its antiviral activity. Here we have exposed respiratory syncytial virus (RSV) to THP1-induced macrophages to explore how RNase 2 affects the virus-exposed cells. We have found that RSV can activate the expression of RNase 2 in macrophages and that its presence can reduce the viral load. We also compared the ncRNA populations in wild-type and EDN-knock-out cells, finding significant differences in several tRNAs. In addition, we have confirmed in an ex vivo model that RNase 2 prefers pyrimidines at the base site B1 and adenine at B2. To sum up, in this work we have determined the ECPep-D in vivo antibacterial activity, which appears to be comparable to other reported AMPs. We also have elucidated the RNase 3/1 ability to reduce the resistance acquisition of A. baumannii to colistin, which would be dependent on its catalytic activity. Finally, we have shed light on the tRNA cleavage pattern by RNase 2. All these results will help advancing on the characterization of antimicrobial RNases