Importance des adaptations métaboliques dans la persistance intracellulaire de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus, agent pathogène humain à Gram positif, est l'une des principales causes d'infections bactériennes graves. Des études récentes ont montré que divers types de cellules pouvaient facilement internaliser S. aureus, suggérant que ces cellules infectées pourraient servir de véhicule à la dissémination systémique de l'agent pathogène. L'objectif général de cette thèse était de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans l'adaptation de S. aureus à sa niche intracellulaire. Les données expérimentales obtenues au cours de cette thèse sont présentées sous forme de manuscrits. Dans le premier article, nous nous sommes intéressés au comportement intracellulaire de la souche USA300 de S. aureus dans les cellules endothéliales. Les analyses par video-microscopie ont révélé que la persistance intracellulaire initiale des bactéries correspondait dans certaines cellules à une prolifération bactérienne intracellulaire active conduisant à une lyse cellulaire, et dans d'autres cellules, à une persistance bactérienne sans réplication même une semaine après l'infection. Les résultats obtenus confirment l'idée que les cellules endothéliales pourraient constituer une niche de persistance intracellulaire. Dans le deuxième article, nous nous sommes concentrés sur l'adaptation métabolique de S. aureus au cours de son cycle intracellulaire et notamment au rôle d'une enzyme clé de la voie du pentose phosphate (PPP), la transcétolase (TKT). Nous avons montré que l'inactivation du gène codant la TKT activité chez S. aureus USA300 (Δtkt) entraînait des modifications métabolomiques importantes. En utilisant l'imagerie vidéo-microscopie et le modèle murin in vivo, nous avons observé un défaut majeur de la souche delta tkt par rapport à la souche sauvage dans la prolifération intracellulaire précoce et dans la capacité de coloniser les reins des souris infectées. La transcription des régulateurs Sigma B et RpiRc s'est révélée considérablement réduite chez le mutant Δtkt pendant l'invasion des cellules hôtes alors que et la transcription de l'ARN III était augmentée ; suggérant que TKT - ou un PPP fonctionnel - influencerait la capacité de S. aureus à proliférer dans les cellules hôtes par la modulation de transcription de ces régulateurs clés. Enfin, dans le troisième article, nous avons étudié l'adaptation de S. aureus au cours d'une infection chronique chez des patients atteints de mucoviscidose. Nous avons sélectionné des paires d'isolats séquentiels de S. aureus provenant de trois patients atteints de mucoviscidose. Nous avons montré que les isolats tardifs de S. aureus provenant de patients mucoviscidose avaient une capacité accrue de survie intracellulaire dans les cellules F508del de l'épithélium bronchique mucoviscidose par rapport aux isolats précoces. La capacité accrue de persistance intracellulaire d'un isolat tardif de S. aureus a été confirmé dans les cellules épithéliales F508del du même patient. Les analyses proteo-génomiques et metabolomiques de ces isolats ont permis d'identifier les modifications génétiques responsables des profils d'expression protéique altérés et des modifications métaboliques engendrées. L'ensemble des résultats obtenus suggèrent que l'environnement intracellulaire pourrait constituer une niche importante de persistance et de rechute, nécessitant des traitements antibiotiques adaptés.The Gram-positive human pathogen Staphylococcus aureus is a leading cause of severe bacterial infections. Recent studies have shown that various cell types could readily internalize S. aureus and infected cells have been proposed to serve as vehicle for the systemic dissemination of the pathogen. The general objective of this thesis was to understand the molecular mechanisms involved in the adaptation of S. aureus to its intracellular niche. The experimental data obtained during this thesis are presented under the form of articles. In the first article, we addressed the intracellular behavior of the S. aureus strain USA300 in endothelial cells. Time-lapse microscopy revealed that initial intracellular persistence of wild-type bacteria corresponded to distinct single cell events, ranging from active intracellular bacterial proliferation, leading to cell lysis, to non-replicating bacterial persistence even one week after infection. These findings support the notion that endothelial cells might constitute an intracellular persistence niche responsible for reported relapse of infection after antibiotic therapy. In the second article, we focused on the metabolic adaptation of S. aureus during its intracellular cycle and in particular the role of a key pentose phosphate pathway (PPP) enzyme, transketolase (TKT). We showed that inactivation of the gene encoding TKT activity in S. aureus USA300 (Δtkt) led to drastic metabolomic changes. Using time-lapse video imaging and mice infection, we observed a major defect of the Δtkt strain compared to wild-type strain in early intracellular proliferation and in the ability to colonize kidneys. Transcriptional activity of the two master regulators Sigma B and RpiRc was drastically reduced in the Δtkt mutant during host cells invasion and concomitantly RNAIII transcription increased, suggesting that TKT -or a functional PPP- influences the ability of S. aureus to proliferate within host cells by modulating key transcriptional regulators. In the third manuscript, we studied the adaptation of S. aureus during a chronic infection, in cystic fibrosis (CF) patients. We selected pairs of sequential S. aureus isolates from 3 patients with CF. We showed that late S. aureus isolates from CF patients had an increased ability for intracellular survival in CF bronchial epithelial-F508del cells compared to ancestral early isolates. The increased ability to persist intracellularly was confirmed for one S. aureus late isolate within the own-patient F508del epithelial cells. Proteo-genomic and metabolomics analyses of these isolates led us to identify the underlying genetic modifications that induced altered protein expression profiles and notable metabolic changes. Altogether our results strongly suggest that the intracellular environment might constitute an important niche of persistence and relapse necessitating adapted antibiotic treatments