HPLC of Bioactive Compounds

Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra: Biofyziky a fyzikální chemie Školitel: Ing. Vladimír Kubíček, CSc. Student: Aneta Lukšanová Název diplomové práce: HPLC bioaktivních látek Diplomová práce popisuje hledání podmínek pro HPLC analýzu midazolamu a jeho dvou metabolitů - 1-hydroxymidazolamu a 4-hydroxy midazolamu, validaci metody a hledání vhodného vnitřního standardu. HPLC analýza probíhala na reverzních fázích, byla použita kolona POROSHELL 120 EC-C18, 3.0 X 100 NM, 2.7 µm a jako mobilní fáze se osvědčila směs tvořená acetonitrilem a roztokem octanu amonného o pH 4.5 v poměru 35/65. Detekce byla provedena diode array detektorem při vlnových délkách 223 a 272 mm. Kolona byla termostatována na 25 řC, čas analýzy byl 10 minut. Rychlost průtoku mobilní fáze byla 0.700 ml/min. Jako vnitřní standard se osvědčil diazepam. Metoda byla validována na základě požadavku zadavatele pro stanovení 1- hydroxymidazolamu a 4-hydroxymidazolamu v potkaní plazmě. V rámci validace byly ověřeny následující parametry: přesnost, správnost, kvantitativní limit, linearita a selektivita.Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of: Biophysics and Physical Chemistry Consultant: Ing. Vladimír Kubíček, CSc. Student: Aneta Lukšanová Title of thesis: HPLC of bioactive compounds This diploma thesis is focused on finding conditions of HPLC analysis of midazolam and it's two metabolites - 1-hydroxymidazolam and 4-hydroxymidazolam, on method validation and on finding an appropriate internal standard. The analysis was carried out under reversed-phase conditions, the chosen column was POROSHELL 120 EC-C18, 3.0 X 100 NM, 2.7 µm, and a mixture of acetonitrile and ammonium acetate buffer with pH 4.5 in a ratio of 35/65 has been proven to be effective mobile phase. Detection was carried out using the diode array detector with wavelength values 223 nm and 272 nm. The column was thermostated at 25 řC, the analysis time was 10 minutes. Flow rate of mobile phase was 0.700 ml/min. Diazepam was found as a suitable internal standard. The method was validated only for 1-hydroxymidazolam and 4-hydroxymidazolam determination in rat plasma due to a submitter's request. Within the analytic method validation the following parameters were tested: precision, accuracy, lower limit of quantitation, linearity and selectivity.Katedra biofyziky a fyzikální chemieDepartment of Biophysics and Physical ChemistryFarmaceutická fakulta v Hradci KrálovéFaculty of Pharmacy in Hradec Králov