Recombinant production and characterization of new bacterial heme peroxidases at the origin of the peroxidase-cyclooxygenase superfamily

Häm-Peroxidasen, eisenhältige Oxidoreduktasen, sind Teil der angeborenen Immunabwehr des Menschen. Die gängigsten Vertreter von diesen Metalloproteinen sind Myeloperoxidase (MPO), Eosinophile Peroxidase (EPO), Lactoperoxidase (LPO) und Thyroid Peroxidase (TPO). Das Ergenbis eines umfassenden Aminosäure-Sequenzvergleichs zeigte hohe Ähnlichkeiten zweier cyanobakteriellen Peroxidasen von Lyngbya sp. (PCC 8106) und Microcoleus chthonoplastes (PCC 7420) mit diesen humanen Enzymen. Beide bakteriellen Peroxidasen scheinen am Ursprung der Peroxidase-Cyclooxygenase Superfamilie zu stehen. Das Ziel der Arbeit war die rekombinante Produktion in E. coli dieser beiden Proteine und die biochemische Charakterisierung. Die entsprechenden DNA-Segmente wurden aus genomischer DNA amplifiziert, in den pET-21a (+) Vector geklont und in Escherichia coli BL21 Star (DE3) überexprimiert. Die Reinigung erfolgte durch Metall-Chelat-Affinitäts-Chromatography (MCAC). Mittels spektroskopischer Techniken (UV-Vis-, Circular Dichroismus) und kinetischer Untersuchungen (Steady-state und Stopped-flow Spektroskopie) wurden Struktur und Funktionalität der beiden Enzyme untersucht. Beide cyanobakteriellen Peroxidasen zeigten klassische Peroxidaseaktivität. Interessanterweise wurde - in Analogie zu humanen Peroxidasen - auch eine Chlorierungs- und Bromierunsaktivität gemessen. Die physiologische Relevanz dieser Enzymaktivitäten in Bakterien ist noch nicht erforscht.Heme peroxidases, iron-containing oxidoreductases, are part of the human innate host defense system. The most common representatives of these metalloproteins are myeloperoxidase (MPO), eosinophil peroxidase (EPO), lactoperoxidase (LPO) and thyroid peroxidase (TPO). The result of a comprehensive amino acid sequence alignment showed high similarities between two cyanobacterial peroxidases from Lyngbya sp. (PCC 8106) and Microcoleus chthonoplastes (PCC 7420) with these human enzymes. This result was remarkably because the two peroxidases are even at the phylogenetic origin of the peroxidase-cyclooxygenase superfamily. The aim of this work was to characterize these two peroxidases in detail and to compare their properties with those of human peroxidases. The peroxidase genes were amplified from genomic DNA, cloned in a pET-21a (+) vector and overexpressed in Escherichia coli BL21 Star (DE3). The two proteins were purified by metal-chelate affinity chromatography (MCAC) and analyzed by UV-Vis-, circular dichroism (CD)- and stopped-flow spectroscopy. The emphasis respective stopped-flow spectroscopy was placed on the kinetics of hydrogen peroxide conversion and cyanide binding. The peroxidase activities were determined spectrophotometrically and fluorimetrically. Both cyanobacterial enzymes showed peroxidation and halogenation activity including catalysis of chlorination and bromination reactions. However, the physiological relevance of these reactions (known to form the basis of immune defense in human peroxidases) in bacteria is completely unknown yet.submitted by Stefan Alexander TeuferWien, Univ. für Bodenkultur, Dipl.-Arb., 2011(VLID)108334