Cytochrome c oxidases in nitrogen-fixing cyanobacteria

Cyanobakterien waren die ersten Organismen auf der Erde, die durch Photosynthese Sauerstoff bilden konnten. Derzeitige Thesen belegen, dass Cyanobakterien durch sukzessive Veränderung des Elektronentansport- und Enzymsystems der Photosynthese die Atmungskette entwickelt haben, was dazu führte, dass diese Organismen heutzutage sowohl Photophosphorylierung als auch oxidative Phosphorylierung betreiben können. Das filamentöse Cyanobakterium Nostoc sp. PCC 7120, welches Stickstoff in terminal differenzierten Zellen, den sogenannten Heterocysten, fixiert, besitzt neben diesen auch vegetative Zellen. Diese exprimieren zwei verschiedene Cytochrom c Oxidasen, die Schlüsselenzyme der Atmung: in vegetativen Zellen wird das Produkt des coxBACI Gen exprimiert; in Heterocysten findet man hingegen das Produkt des coxBACII Gen. In Organismen, welche oxygene Photosynthese betreiben wird der Elektronentransport vom Cytochrom b6f Komplex zum Photosystem I entweder von Plastocyanin oder Cytochrom c6 durchgeführt. Beides sind kleine, lösliche Metalloproteine, die sich an der P-Seite von Membranen befinden, welche photosynthetische Elektronentransportketten enthalten. Um cyanobakterielle Respiration besser zu verstehen und den Weg der Elektronen innerhalb dieses Systems nachvollziehen zu können, wurde eine verkürzte Form der Untereinheit II von cox2, SUIIj3 cox2 und der Elektronencarrier Plastocyanin in E. coli kloniert, rekombinant exprimiert und durch Chromatographie gereinigt. Rekombinant hergestellte SUII besitzt kein Kupfer in seinem aktiven Zentrum, wodurch dieses durch Rekonstitution zugeführt werden muss. Die Rekonstituierung durch Dialyse mit Harnstoff war zwar erfolgreich, aber sowohl Effizienz, als auch Reproduzierbarkeit waren zu gering. Durch Rekonstitution mittels Ultrafiltration konnte die Ausbeute an reinem, funktionellem Holoprotein gesteigert und ein etabliertes Protokoll erstellt werden. Allerdings erreichte die Ausbeute noch keinen akzeptablen Wert und die Stabilität des Produktes war mangelhaft, weshalb es nicht möglich war, kinetische Messungen durchzuführen. Die Menge an produziertem Plastocyanin war ausreichend für weitere kinetische Analysen und die Reinheit gleichermassen sehr hoch.Cyanobacteria were the first organisms on earth to produce O2 by photosynthesis. Gradual modification of the preexisting photosynthetic electron transport and enzyme systems could have changed a photosynthetic into a respiratory chain and today cyanobacteria are capable of both, photophosphorylation and oxidative phosphorylation. Nostoc sp. PCC 7120 is a filamentous cyanobacterium which can fix nitrogen in terminally differentiated cells called heterocysts. Heterocysts and vegetative cells express two different cytochrome c oxidases, the key enzyme of respiration: in vegetative cells the product of the coxBACI (cox1) gene is found, whereas heterocysts express coxBACII (cox2). It is well known that in oxygenic photosynthesis the transport of electrons from the cytochrome b6f complex to PSI is performed by either plastocyanin (PC) or cytochrome c6 (Cyt c6), which are both small soluble metalloproteins located on the P-side of membranes containing photosynthetic electron transport. Plastocyanin (encoded by the petE gene) consists of a single polypeptide chain forming a -barrel with eight -strands and a small -helix, along with a type-1 blue copper center. In order to understand more about cyanobacterial respiration and stress mechanism, a truncated form of the subunit II of cox2, SUIIj3 cox2 (carrying the electron binding site and electron entry site) and plastocyanin were cloned, recombinantly expressed in E. coli and purified with chromatography. Recombinant SUIIj3 cox2 lacks copper in its active site and had to be reconstituted. Reconstitution by dialysis with urea was successful but the reconstitution efficiency was not satisfying. Reconstitution by ultrafiltration with urea led to higher amount of pure, functional holoprotein, but still not sufficient to perform kinetic measurements. Additionally the stability of the pure, functional holoprotein was not guaranteed due to loss of the attached copper during reconstitution. The amount of produced plastocyanin was adequate and the protein solution held the necessary pureness to perform further kinetic measurements.eingereicht von Martin PairerZsfassung in dt. SpracheWien, Univ. für Bodenkultur, Dipl.-Arb., 2009(VLID)108313