Quantitative analysis of NADP+ and NADPH in yeast

Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (NADP) ist ein wichtiger Redoxkofaktor im Anabolismus aller Zellen. Das Verhältnis der reduzierten Form (NADPH) und der oxidierten Form (NADP+) trägt wesentlich zum Redoxstatus der Zelle bei. Die genaue Bestimmung der intrazellulären Konzentration von NADP+ und NADPH ist allerdings aufgrund von methodischen Komplikationen schwierig. Insbesondere die Instabilität von NADPH stellt vor allem bei der Extraktion der Analyten aus dem Zielorganismus Pichia pastoris ein großes Hindernis dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden mehrere kalte, heiße und mechanische Extraktionsmethoden bezüglich der Ausbeute und der Stabilität der Analyten in den Extraktionsbedingungen getestet. Zur chromatographischen Trennung der beiden Substanzen wurden mehrere Trennmechanismen mit massenspektrometrischer Detektion getestet. Der im Rahmen dieser Arbeit etablierte analytische Prozess gliedert sich in die Schritte (1) Probenvorbereitung mittels heißer wässriger Extraktion bei pH 8,0, (2) chromatographische Trennung in Umkehrphasenbedingungen bei pH 6.0 innerhalb einer Gesamtlaufzeit von 12 min sowie (3) Elektrospray-Ionisierung und Detektion mittels Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie. Die Daten aus dieser Analyse sind dafür geeignet, Aussagen über den intrazellulären NADP-Gehalt von Hefen zu treffen.Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP) is a coenzyme and redox agent involved in many anabolic reactions in all cell types and organisms. The ratio of the reduced form (NADPH) and the oxidized form (NADP+) contributes to the overall redox state of the cell. There are currently only estimates of the intracellular levels of these compounds since the accurate determination is hindered by methodological problems. The instability of NADPH under various conditions restricts the available options for metabolite extraction from the cell. In this work, a variety of cold, hot and mechanical extraction protocols was evaluated concerning their ability to give access to the intracellular NADP pool of the target organism of this work, the yeast Pichia pastoris as well as the stability of NADP+ and NADPH in the extraction conditions. Different separation mechanisms and columns were tested to develop an analytical method for the chromatographic separation of NADPH and NADP+ from cell extracts. Time-of-flight and triple quadrupole mass spectrometry were used for detection. The overall analytical workflow established in this work includes sample preparation using aqueous hot extraction at pH 8.0, chromatographic separation in reversed-phase conditions at pH 6.0 within a total run time of 12 min with mass spectrometric detection using electrospray ionization and a triple quadrupole mass analyzer. It was shown that this procedure delivers data fit for the evaluation of intracellular NADP levels in yeast.Karin OrtmayrZsfassung in dt. SpracheWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2013(VLID)108260