Traditional and in vitro cultivation of Crotalaria retusa for isolation, identification and quantification of pyrrolizidine alkaloids

Plantas do gênero Crotalaria possuem um crescimento rápido e se adaptam bem ao clima tropical, sendo de fácil cultivo. Dentre as Crotalárias destacam-se a Crotalaria retusa, C. juncea, C. spectabilis e C. ochroleuca. São plantas muito úteis para no controle de insetos, larvas e nematoides no solo, além do uso como adubo verde no sistema de rotação de culturas e proteção do solo. Tais habilidades estão ligadas ao fato dessas plantas serem capazes de biossintetizar alcaloides pirrolizidínicos como metabólitos secundários. O principal alcaloide isolado e estudado até hoje em espécies desse gênero é a monocrotalina. É muito tóxico e pode causar complicações hepatotóxicas graves em animais vertebrados. Sendo assim, o estudo dessas plantas e dos alcaloides que elas produzem é muito importante do ponto de vista agrícola e econômico. Com o objetivo de aumentar a produção do teor destes alcaloides foi realizado, neste trabalho, o cultivo in vitro em comparação com o convencional. Assim, o cultivo in vitro foi desenvolvido com sementes de C. juncea e C. ochroleuca. Já o cultivo convencional foi realizado em casa de vegetação, sendo utilizadas as folhas de Crotalaria retusa para extração. Os extratos obtidos foram analisados por infravermelho, RMN e UPLC- QTOF-MS. Os dados gerados foram processados no software MassLynx versão 4.1 e tiveram todas as suas fórmulas moleculares possíveis deduzidas a partir da massa exata de cada componente. Os perfis químicos dos extratos foram estabelecidos analisando os cromatogramas em conjunto com os espectros de massa no modo de ionização positiva (ESI+), baseando-se em relatos de metabólitos já descritos na mesma família, gênero e espécie. Com este método foi possível a identificação de dez metabólitos sendo sete alcaloides pirrolizidínicos, três flavonoides e um composto isolado. Os resultados do presente estudo mostraram a eficiência da técnica de infravermelho, RMN e UPLC-QTOF-MS para identificação química dos constituintes dos extratos da Crotalaria retusa, respaldando a realização de ensaios biológicos com os referidos extratos e compostos isolados. Palavras-chave: Crotalaria retusa. Alcaloide pirrolizidínico. Cultura in vitro. LC-MS. Flavonoides.Plants of the genus Crotalaria have a fast growth and adapt well to the tropical climate, being easy to grow. Among the Crotalarias, Crotalaria retusa, C. juncea, C. spectabilis and C. ochroleuca stand out. They are very useful plants for controlling insects, larvae and nematodes in the soil, in addition to being used as green manure in the crop rotation system and soil protection. Such abilities are linked to the fact that these plants are able to biosynthesize pyrrolizidine alkaloids as secondary metabolites. These alkaloids are heterocyclic, nitrogenous compounds that behave as bases and can be found in any part of the plant performing various functions in it. The main alkaloid isolated and studied to date in species of this genus is monocrotaline, an extremely toxic alkaloid that can cause severe hepatotoxic complications in vertebrate animals. Therefore, the study of these plants and the alkaloids they produce is very important from an agricultural and economic point of view. In order to increase the production of the content of these alkaloids, in vitro cultivation was performed in comparison with the conventional one. Thus, in vitro culture was developed in the tissue culture laboratory, where seeds of C. juncea and C. ochroleuca were used. Conventional cultivation was carried out in a greenhouse, using Crotalaria retusa leaves for extraction. The extracts obtained were analyzed by infrared, NMR and UPLC-QTOF-MS. The generated data were processed in MassLynx software version 4.1 and had all their possible molecular formulas deduced from the exact mass of each component. The chemical profiles of the extracts were established by analyzing the chromatograms together with the mass spectra in the positive ionization mode (ESI +), based on reports of metabolites already described in the same family, genus and species. With this method it was possible to identify ten metabolites, seven pyrrolizidine alkaloids, three flavonoids and an isolated compound. The results of the present study showed the efficiency of the infrared, NMR and UPLC- QTOF-MS technique for chemical identification of Crotalaria retusa extracts, supporting the performance of biological tests with the said extracts and isolated compounds. Keywords: Crotalaria retusa. Pyrrolidizine alkaloid. In vitro culture. LC-MS. Flavonoids