Preclinical development of a T cell based gene therapy to treat IPEX syndrom

Le syndrome IPEX (Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked) est provoqué par des mutations du gène codant pour le facteur de transcription FOXP3 qui entraînent la perte de fonction des lymphocytes T régulateurs (Treg). L'absence de Tregs fonctionnels conduit au développement de manifestations auto-immunes dans les premiers mois ou les premières années de vie. Le traitement actuel repose sur l'association d'immunosuppresseurs. Le seul traitement curatif à ce jour est la greffe de cellules souches hématopoïétiques. Cependant ces deux stratégies thérapeutiques sont associées à la survenue de complications conduisant dans certains cas au décès du patient. Dans ce contexte clinique peu favorable, mon projet de thèse a consisté à développer une thérapie génique visant à conférer des propriétés régulatrices aux lymphocytes T autologues par transduction lentivirale du cDNA du gène FOXP3 humain. Des travaux antérieurs avaient mis en évidence que le facteur de transcription FOXP3, bien qu'indispensable au développement et à la fonction des Tregs, n'induisait qu'une signature Treg partielle et instable lorsqu'il était introduit de manière ectopique. Ces résultats suggérent la nécessité d'une expression forte et stable induite par la transduction par un vecteur lentiviral associée à un marqueur de surface permettant de sélectionner les cellules transduites. Par ailleurs, le seul modèle murin préclinique disponible, la souris Scurfy porteuse d'une mutation spontanée du gène Foxp3, était inutilisable pour tester un traitement curatif en raison de la mortalité précoce des animaux. Enfin les lymphocytes T murins, en particulier ceux des souris Scurfy, sont très peu perméables à la transduction par un lentivirus. Au cours de ma thèse j'ai identifié parmi plus de 4 constructions lentivirales possibles celle permettant une expression stable de FOXP3, corrélée avec celle d'une protéine membranaire LNGFR permettant la sélection des cellules génétiquement modifiées. J'ai mis au point un test fonctionnel in vivo des lymphocytes Tregs murins basé sur le transfert adoptif dans le modèle auto-immun Scurfy combiné à un conditionnement par cyclophosphamide, et à un traitement par Interleukine-2 favorisant l'expansion des Treg. La surveillance quotidienne des animaux traités a été effectuée selon un score de suivi spécifique que j'ai développé. J'ai démontré grâce à ce protocole la capacité des Tregs à diminuer considérablement la symptomatologie Scurfy et à augmenter d'un facteur 3 leur survie. J'ai également mis au point un protocole de transduction efficace des cellules T CD4 murines. Grâce à ces développements, j'ai démontré que le transfert du gène FOXP3 humain dans des lymphocytes T CD4+ de souris Scurfy permettait la génération de lymphocytes Tregs présentant une fonction suppressive non seulement in vitro mais également in vivo avec la réduction du score Scurfy et une augmentation de la survie de 30 à 90 jours. Ces résultats ouvrent la voie au développement clinique d'une thérapie génique basée sur les lymphocytes T CD4 afin de restaurer la tolérance dans le but de guérir les patients souffrant du syndrome IPEX. Plus largement, cette stratégie thérapeutique pourrait être appliquée à d'autres pathologies auto-immunes sévères ou encore de permettre de favoriser la tolérance dans le contexte de la transplantation allogénique.IPEX (Immunodysregulation Polyendocrinopathy Enteropathy X-linked) syndrome is caused by mutations in the gene encoding the transcription factor FOXP3, which leads to the loss of function of regulatory T (Treg) lymphocytes. The absence of functional Tregs leads to the development of autoimmune manifestations in the first months or years of life. IPEX syndrome treatment is based on the association of immunosuppressive drugs. Hematopoietic stem cell transplantation is the only curative treatment. However both strategies result in severe complications eventually leading to patients' death. In this severe clinical situation, my PhD project aimed to develop a gene therapy approach designed to confer regulatory properties to autologous T lymphocytes based on lentiviral transduction of human FOXP3 cDNA. Previous publications demonstrated that ectopic expression of the transcription factor FOXP3, despite being mandatory for Treg induction and function, was only able to induce a partial and unstable Treg transcriptomic program. These results suggest the need for a stable and strong expression of FOXP3 upon lentiviral transduction with a correlated expression of a cell surface marker to allow selection of transduced cells. Furthermore, the only preclinical in vivo model of IPEX syndrom, the Scurfy mice that present a spontaneous mutation in the Foxp3 gene was not suitable for preclinical evaluation due to short life expectancy. Lastly, murine T lymphocytes and in particular Scurfy T lymphocytes are refractory to lentiviral transduction. During my PhD project, I selected among more than four lentiviral constructions the one allowing a stable expression of FOXP3, correlated with the expression of a membranous protein, LNGFR allowing selection of transduced cells. I set up an in vivo assay to evaluate the functionality of regulatory T cells based on their adoptive transfer in the autoimmune Scurfy model combined with a preconditionning by cyclophosphamide and an in vivo Interleukine-2 treatment promoting Tregs expansion. I developed a specific score for daily mice follow-up. Using this model, I demonstrated the ability of Tregs to control Scurfy symptoms and improve life expectancy by 3-fold. I also set up a transduction assay for murine CD4 T cells. Based on these improvements, I demonstrated that human FOXP3 gene transfer into murine Scurfy CD4+ T cells enables the generation of potent regulatory T cells, and to restore a regulatory population with functional suppressive properties as demonstrated in vitro but also in vivo by a reduction of Scurfy score and an improvement of life expectancy from 30 to 90 days. These results pave the way to the clinical development of a gene therapy treatment to restore tolerance and cure IPEX syndrome. Moreover, this therapeutic strategy could be extended to other autoimmune diseases and could also allow favor tolerance in the context of allogeneic transplantation