Exploiting RKIP protein as a potential predictor of HER targeted therapies response in Cervical Cancer

Dissertação de mestrado em Ciências da SaúdeCervical cancer (CC) is estimated to account for 8% of the total cancer related mortality in women worldwide, and for who platinum based chemotherapy is just palliative. Hopefully, our group found that HER receptors are good targetable proteins for fighting CC, however, resistance to that drugs remains an enormous clinical problem for other tumor types. Thus, aiming to anticipate the putative molecular mechanisms of resistance, in order to establish predictors of therapy response in CC, herein, it was hypothesized that RKIP tumor suppressor protein could be modulating cells response to HER targeted therapies: first, because of the knowledge that RKIP is downregulated in CC tissues; secondly due of its crucial role in the regulation of important signaling pathways in oncogenesis and therapy prediction, such MAPK pathway. To address our hypothesis, we first recurred to in vitro models that were knocked out for RKIP by using CRISP-Cas9 technology. The genetic manipulated cell lines were used to study the impact of RKIP in HER signalling cascade activation, which was evaluated by western blot. Importantly, the role of RKIP in modulation of response to HER-targeted drugs (AST1306, lapatinib and afatinib) was assessed in the same models by cytotoxic assays. In addition, in vivo CAM assay was used to validate the in vitro findings. Finally, a series of 202 adenocarcinoma human tissues were used to assess RKIP immunohistochemistry to validate some of the findings as well as its prognostic significance. In general, it was found for the first time that even not having a crucial role in intracellular signaling modulation, RKIP and HER receptors showed to be regulating each other, a finding that was consistent in the in vitro models as in the human samples. Additionally, and in contrast to what was expected due to its known negative regulatory role in MAPK pathway, we observed that absence of RKIP expression is a favorable condition for a better response to HER inhibitors. Importantly, these associations were found only for cells that showed to have a RKIP-dependent signaling. Further, we were also able to demonstrate an association between RKIP decrease expression and CC patient’s worse prognosis. In conclusion, the results presented in this thesis provided us important preliminary data that opened us a huge window for future works.O cancro do colo do útero é responsável por 8% da mortalidade total relacionada com cancro em mulheres em todo o mundo, sendo a quimioterapia apenas paliativa. Felizmente, o nosso grupo identificou os recetores HER como proteínas alvo para terapia contra o cancro do colo do útero, contudo, a resistência a estas terapias em outros tumores constitui um entrave à sua utilização. Desta forma, com o objetivo de conhecer os mecanismos moleculares de resistência, para estabelecer os preditores de resposta a terapias em cancro do colo do útero, surge como hipótese que a proteína RKIP, conhecida como uma supressora tumoral, possa modular a resposta celular a terapias anti-HER: primeiro, devido ao conhecimento de que a RKIP está subexpressa em CC; Em segundo lugar, devido ao seu papel crucial na regulação de importantes vias de sinalização na oncogénese e na predição da resposta a terapias, como a via MAPK. Para explorar a nossa hipótese, recorreu-se inicialmente a modelos in vitro para os quais foi realizado o knockout da RKIP recorrendo a tecnologia CRISP-Cas9. As linhas celulares geneticamente manipuladas foram utilizadas para estudar o impacto do RKIP na ativação da cascata de sinalização HER, por western blot. O papel do RKIP na modulação da resposta a terapias anti-HER (AST1306, lapatinib e afatinib) foi avaliado nos mesmos modelos por ensaios de citotoxicidade. Além disso, o ensaio in vivo da CAM foi utilizado para validar os resultados in vitro. Finalmente, uma série de 202 de tecidos de adenocarcinomas humano foram utilizados para avaliar a expressão de RKIP de forma a validar alguns dos resultados, bem como o seu valor prognóstico. No geral, descobriu-se pela primeira vez que mesmo não tendo um papel crucial na modulação da sinalização intracelular, os recetores HER e a RKIP regulam-se mutuamente, uma descoberta consistente tanto em modelos in vitro como em amostras humanas. Além disso, e em contraste com o esperado devido ao seu conhecido papel como regulador negativo da via MAPK, observamos que a ausência de expressão de RKIP é uma condição favorável para uma melhor resposta aos inibidores de HER. Estas associações foram encontradas apenas para células que mostraram ter uma sinalização RKIP-dependente. Além disso, também demonstramos uma associação entre o decréscimo da expressão de RKIP e um pior prognóstico dos pacientes. Em conclusão, os resultados apresentados nesta tese forneceram-nos dados preliminares importantes que nos abriram uma enorme janela para trabalhos futuros.Por último, gostava ainda de referenciar que o financiamento para a realização deste projeto provém dos fundos do Programa Operacional Regional do Norte (NORTE 2020), sobre o Acordo de Parceria PORTUGAL 2020, através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), que por sua vez advém do Programa Operacional Fatores de Competitividade – COMPETE, e dos fundos nacionais através da Fundação para a Ciência e Tecnologia sobre POCI-01-0145-FEDER-007038; e sobre o projeto NORTE-01-0145-FEDER-000013