Caracterização de celulases derivadas de cepas recombinantes de Trichoderma reesei e uso no tratamento de fibras celulósicas comerciais

Orientador: Prof. Dr. Luiz Pereira RamosTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Curso de Pós-Graduação em Processos BiotecnológicosInclui referências: p. 158-174Área de concentração: AgroindústriaResumo: Preparações enzimáticas obtidas a partir de cepas recombinantes do fungo Trichoderma reesei (Rohm Enzyme Finland Oy, Finlândia) foram inicialmente caracterizadas com relação às suas atividades específicas e teor protéico, sendo posteriormente comparadas a um sistema celulásico completo representado pela preparação industrial Celluclast 1.5L® (Novo Nordisk). Foram oito as preparações enzimáticas obtidas a partir das cepas recombinantes, a saber, quatro enzimas de supressão isolada (A, CBH I-; B, CBH II-; C, EG I-; D, EG II-), duas de supressão dupla (E, CBH I/II-; F, EG I/II-) e duas de supressão tripla (G, EG II-/CBH I/H-; H, CBH II-/EG I/n-). A atividade protéica das enzimas recombinantes mostrou-se substancialmente diferente da atividade observada em Celluclast 1.5L®. Esta observação foi decorrente do ensaio de atividade contra vários substratos incluindo papel de filtro, celobiose, p-nitrofenil-glucosídeo, p-nitrofenil-lactosídeo, xilana de aveia, xilana de vidoeiro, carboximetilcelulose, hidroxietilcelulose (HEC) e azocaseína. A inclusão desse último substrato foi necessária para que se pudesse demonstrar a presença de atividade proteásica residual em todas as preparações enzimáticas. A análise cromatográfica por FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) foi usada para separar os componentes das preparações celulásicas de acordo com o pi e raio hidrodinâmico, seguindo-se de análises de atividade específica em cada fiação coleta. A coeluição de CBH II com outras enzim as presentes no sistema celulásico (por exemplo, EG I) foi caracterizada por ensaios imunoquímicos utilizando anticorpos monoclonais, enquanto que a ocorrência de EG II foi testada baseando-se na capacidade da fiação enzimática em hidrolisar a ligação heterosídica do metilumbeliferil-ß-D-celotriosídeo. Por outro lado, a presença do domínio catalítico de CBH I em frações específicas do FPLC foi determinada por cromatografia de interação hidrofóbica, sendo que o ensaio contra metilumbeliferil-ß-D-celotriosídeo, na presença e ausência de celobiose, serviu de estratégia para confirmar a ausência de EG I nos volumes de eluição de CBH I e de seu respectivo domínio catalítico livre. Os principais constituintes proteicos do sistema celulásico de T. reesei foram separados em cinco frações: EG II e Hl na fração Fl, EG II e CBH II na fração F2, CBH II e EG I na fração F3, EG I na fração F4 e CBH I na fração F5. Entretanto, para todas as enzimas de A a H, a fração do FPLC (fração F5) que continha a CBH I, esta fração para muitas das enzimas demonstrou ser quase que exclusivamente constituída de domínio catalítico livre. Em condições específicas de hidrólise (4 mg de proteína por grama de polpa seca por 2 horas à 45°C, 145 rpm) foram ensaiadas fibras celulósicas de pinus e eucalipto provindas de processo Kraft, nenhuma das preparações enzimáticas em estudo apresentou um efeito significativo sobre o grau de polimerização da celulose. A única exceção a esta regra foi o comportamento da enzima E sobre polpa de eucalipto, provavelmente devido a sua alta atividade específica sobre substratos de caráter amorfo mais pronunciado (alta atividade endoglucanásica). A enzima G forneceu os melhores resultados sobre as propriedades de polpas Kraft branqueadas de eucalipto para a confecção do papel. Ganhos foram observados em quase todas as propriedades mecânicas às quais os corpos de prova foram submetidos. No entanto, um pequeno efeito foi detectado sobre a resistência ao rasgo dos corpos de prova. A enzima G também apresentou um efeito bastante favorável sobre as propriedades da polpa Kraft branqueada derivada de pinus. Um aumento de 36% na resistência à tração foi observado nos corpos de prova ensaiados sem que qualquer efeito fosse detectado nas resistências ao alongamento e arrebentamento (estouro). Porém, a resistência ao rasgo foi comprometida em cerca de 22% em relação ao controle. Computados os efeitos sobre todas as propriedades dos corpos de prova, a enrima H foi a que proporcionou o melhor resultado sobre polpas de pinus porque não apresentou qualquer efeito negativo sobre a resistência ao rasgo.Abstract: Enzyme preparations from eight deletion strains of Trichoderma reesei were initially characterized in regard to their specific activities and protein profile and subsequently compared to the complete cellulase system of the industrial enzyme preparation Celluclast 1.5L (Novo Nordisk). The enzyme preparations derived from recombinant strains of T. reesei were kindly provided by Rohm Enzyme Finland Oy and were formerly classified as mono, di and tri-deletion preparations, namely 4 single (A, CBHI-; B, CBHII-; C, EG I-; D, EG II-), 2 double- (E, CBHI/H-; F, EG I/II-) and 2 tri-deletion enzymes (G, EG II-/CBH I/E-; H, CBH II-/EGI/II-). The activity profile of the recombinant enzymes was shown to be substantially different from that of Celluclast 1.5L. This was observed against a range of model substrates including filter paper, cellobiose, p-nitrophenyl-glucoside, pnitrophenyl- lactoside, oat spelt xylan, larchwood xylan, carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose (HEC) and azocasein. Inclusion of the latter substrate was required because all of the enzyme preparations were shown to variable amounts of residual protease activity. Fast protein liquid chromatography was used to characterize each cellulase preparations in regard to their protein profile and specific activity against HEC. The band-spreading and/or co-elution of CBH II with other enzyme components of the cellulase system (e.g., EG I) was characterized by immunochemical assays using monoclonal antibodies, whereas the occurrence of EG II was assessed based on the capability of the enzyme fractions to cleave the heterosidic bond of methylumbellyferyl-ß-D-cellotrioside. On the other hand, the occurrence of CBH I core protein within the CBH I fraction of the FPLC profile was determined by hydrophobic interaction chromatography. This CBH I fraction, containing either the truncated or untruncated enzyme, was also assayed against methylumbellyferyl-ß-Dlactoside, in the presence and absence of cellobiose, to ensure that this protein band was not contaminated with any EG I activity. The main protein constituents of the T. reesei cellulase system were pooled into five fractions containing EG II and HI (fraction 1), EGII and CBH II (fraction 2), CBH II and EG I (fraction 3), EG I (fraction 4) and CBH I (fraction 5). However, the CBH I fraction of the FPLC profile (fraction 5) was demonstrated to be almost exclusively composed of the CBH I core protein in all of the recombinant enzyme preparations. Under the conditions used for fiber modification (4 mg of protein per gram of dry pulp for 2 h at 45°C, 145 rpm), none of the enzyme preparations had a significant effect of pulp cellulose degree of polymerization. The only exception to this rule was enzyme E on eucalyptus pulp, probably due to its high specific activity against amorphous cellulose (high endoglucanase activity). Enzyme G provided the best treatment for fiber modification of eucalypt Kraft pulps, with improvement of all mechanical properties tested in this study except tearing. The enzyme G also had a favorable effect on pine Kraft pulp. A 36% increase in tensile strength was observed with no detectable effect on both stretching and bursting strength, but handsheet tearing was decreased by 22% in relation to the control. However, enzyme H provided the best handsheet properties of pine Kraft pulps. These results provide further evidence to the widely accepted contribution that genetic engineering may have to the development of efficient enzymes systems to modify pulp fibers. In this regard, both double and three deletion enzymes derived from recombinant T. reesei strains have shown interesting properties for fiber modification in pulp and paper manufacturing