Développements pour l'imagerie quantitative et à haut contenu en microscopie de fluorescence classique et super-résolue

Fluorescence and Single Molecule Localization Microscopy (SMLM) allows for thespecific labeling and imaging of biological samples, and are an essential tool for biologists.However, images are generally non-quantitative and limited in feld of view, as well as in imagingtimes. These limits are fundamentally linked to the illumination scheme, which should be optimized both in term of uniformity, but also in control of the irradiance. We propose a novelillumination scheme named ASTER, which allow for a versatile and uniform illumination and is compatible with classical optical sectioning schemes. We first apply ASTER to fluorescence microscopy and particularly the imaging of live dynamic samples. Then we show the ability toobtain uniform resolution in SMLM, as well as the potential of ASTER's versatility. One mayreduce the uorescent background, image wide200 x 200 µm² fields, or realize a SMLM image under a minute. Finally, we present theimplementation of a multicolor SMLM experiment, allowing for the simultaneous imaging ofdifferent structures with cross-talks around 2%.This method is quanti ed and optimized, andthen applied to two and three color imaging, aswell as 3D imaging. Different perspectives for ASTER and multicolor imaging are then proposed.La microscopie de fluorescence et la microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM) permettent d’imager spécifiquement les entités subcellulaires et sont donc des outils indispensables en Biologie. Cependant ces techniques d’imagerie sont intimement liées aux propriétés de l’illumination, qui possède des limites en termes d’uniformité et de contrôle de l’éclairement.Nous proposons une nouvelle méthode d’illumination nommée ASTER (Adaptable Scanning for Tunable Excitation Regions), capable de délivrer une illumination modulable et uniforme, et compatible avec les méthodes de sectionnement optique classiques. Nous l’appliquons en premier lieu à la microscopie de fluorescence où nous montrons sa compatibilité avec l’imagerie d’échantillons vivants. Ensuite, dans le contexte de l’imagerie SMLM nous démontrons l’obtention de résolutions uniformes, mais également l’impact sur d’autres paramètres et possibilités d’acquisitions. Ainsi ASTER permet de réduire le fond ambiant, d’imager des champs larges de 200x200µm² ou de réaliser une image SMLM sur l’ordre de quelques minutes.Nous présentons ensuite le bénéfice du couplage d’ASTER avec l’imagerie 3D, et une méthode d’imagerie multi-couleur SMLM. Cette méthode quantifiée analytiquement permet d’obtenir des cross talk de l’ordre de 2%, nous montrons sont application à l’imagerie à deux et trois couleurs, ainsi qu’à l’imagerie 3D. Différentes pistes d’amélioration d’ASTER et de l’imagerie multi couleur sont ensuite proposées