Development of collagen/hydroxyapatite composites with angiogenic properties

Die beiden Schlüsselkomponenten für die Entwicklung von Knochengewebe sind osteogene Stamm- oder Vorläuferzellen und ein dreidimensionales Gerüstmaterial. In der vorliegenden Arbeit wurden zum einen das Gerüst und zum anderen spezifische Stammzellen hinsichtlich ihrer angiogenen Eigenschaften untersucht. Da die beiden Prozesse Angiogenese und Knochenbildung miteinander gekoppelt sind, ist es für gewebezüchtete Konstrukte von entscheidender Bedeutung, dass sie eine Gefäßdurchblutung aus dem umgebenden Gewebe der Implantationsstelle ermöglichen und induzieren. Auf der Grundlage der experimentellen Ergebnisse lassen sich die wichtigsten Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit wie folgt zusammenfassen: 1) Das Ziel der ersten Arbeit war es, die angiogenen Eigenschaften von Kollagen/Hydroxylapatit-Gerüsten zu verbessern. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde ein VEGF-Mimicry Peptid an Hydroxylapatitpartikel gekoppelt, bevor die Gerüste hergestellt wurden. Es konnte bestätigt werden, dass das VEGF-mimetische Peptid QK, das mit einem Heptaglutamat-Rest (E7-Tag) modifiziert wurde, eine deutlich höhere Bindungsaffinität zu Hydroxylapatit-Partikeln aufweist als das unmodifizierte QK-Peptid. Die Quantifizierung von Tube Formation Assays ergab eine signifikant höhere Anzahl an Tubes, die von HUVECs in Gegenwart von E7-QK-Peptiden gebildet wurden, als in Gegenwart des unmodifizierten QK-Peptids. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass E7-QK-Peptide signifikant pro-angiogene Gene in HUVECs induzieren, verglichen mit den Expressionsniveaus, die in der Kontrollgruppe, die mit unmodifizierten Peptiden kultiviert wurde, festgestellt wurden, und verglichen mit der negativen Kontrollgruppe, die ohne Peptide oder ohne Wachstumsfaktorzusätze kultiviert wurde. In der 3D-Zellkultur zeigten die durchgeführten Sprouting Assays eine signifikant höhere Sprossenbildung von HUVEC-Sphäroiden in Kollagen/Hydroxylapatit-Verbundgerüsten, die die E7-QK-Peptide enthielten, im Vergleich zur detektierten Sprossenbildung in Gerüsten mit unmodifizierten QK-Peptiden. Wir kamen zu dem Schluss, dass E7-QK-Peptide ausgezeichnete angiogene Wirkungen aufweisen und sich sehr gut für die Herstellung von Kollagen/Hydroxylapatit-Verbundwerkstoffen mit angiogenen Eigenschaften eignen. 2) Das Ziel der zweiten Arbeit war die Analyse der angiogenen Eigenschaften von Sekretomen, die aus vorkonditionierten iMSCs gewonnen wurden. Nachdem bestätigt wurde, dass iMSCs auf die IFN-γ-Stimulation unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit einer Hochregulierung der Expression des HLA-II-Moleküls reagieren, wurden die angiogenen Effekte der isolierten iMSC-Sekretome auf HUVECs analysiert. Tube Formation und Wound Healing Assays zeigten in der 2D-Kultur, dass HUVECs, die mit dem Sekretom von iMSCs behandelt wurden, die unter Hypoxie mit IFN-γ konditioniert wurden, eine signifikant höhere Anzahl von Tubes bildeten und die Wunde schneller schlossen als die unbehandelte HUVEC-Gruppe. HUVECs, die in Gegenwart von Sekretomen aus vorkonditionierten iMSCs (mit IFN-γ und Hypoxie) kultiviert wurden, zeigten im Vergleich zu allen anderen Gruppen eine Hochregulierung von sieben pro-angiogenen Genen und eine Herunterregulierung von drei anti-angiogenen Faktoren. HUVEC-Sphäroide, die auf Kollagen/Hydroxylapatit-Scaffolds ausgesät wurden und in Gegenwart des Sekretoms von vorkonditionierten iMSCs (mit IFN-γ und Hypoxie) kultiviert wurden, zeigten eine signifikant höhere Sprossenbildung im Vergleich zu den Sprossen der unbehandelten Gruppe. Wir kamen zu dem Schluss, dass das Sekretom, das von IFN-γ-vorstimulierten iMSCs unter hypoxischen Bedingungen produziert wird, unter allen analysierten Bedingungen die stärkere angiogene Wirkung hervorruft. In einem nächsten Schritt sollte ein geeigneter Ansatz für die Konservierung und den Einbau der Sekretom-Komponenten in die Gerüste entwickelt werden, und beide in dieser Arbeit aufgezeigten Strategien müssen in vivo auf ihre bessere Funktionalität getestet werden