Apoptoseinduktion durch BH3-Mimetika und Bortezomib in Sarkomzelllinien

Sarkome sind eine seltene Gruppe bösartiger Tumorerkrankungen mesenchymalen Ursprungs. Aufgrund ihrer Heterogenität und Rarität stellt die Therapie von Sarkomen auch heute noch eine große Herausforderung dar. Trotz multimodaler Therapiekonzepte einschließlich Chemotherapie, Radiotherapie und ausgedehnter Resektion liegt die 5-Jahres-Überlebensrate bei durchschnittlich lediglich 54-65%. Folglich werden dringend neue wirksame Therapien für die Behandlung von Sarkompatienten benötigt. In Vorarbeiten wurde die synergistische Reduktion vitaler Zellen mittels simultaner Bcl-2-Inhibition durch Venetoclax und Proteasominhibition durch Bortezomib in Weichteilsarkomen nachgewiesen. Ziel dieser Arbeit war es, den Mechanismus der synergistischen Wirkung von Venetoclax und Bortezomib sowie die Relevanz spezifischer Bcl-2 Familienproteine für diesen Mechanismus in drei Sarkomzelllinien (Synovialsarkom, Rhabdomyosarkom und Leiomyosarkom) zu untersuchen, um ein näheres Verständnis des Zusammenwirkens dieser Medikamente zu erlangen. Dazu sollte zunächst die starke Apoptoseinduktion durch gleichzeitige Inkubation mit Venetoclax und Bortezomib durchflusszytometrisch verifiziert und die Übertragbarkeit auf eine Kombination anderer BH3-Mimetika und Bortezomib geprüft werden. Anschließend sollte die Auswirkung einer Inkubation mit Venetoclax und/oder Bortezomib sowohl auf die Expression pro- und anti-apoptotisch wirkender Bcl-2 Proteine als auch die Clusterbildung der MDPs Bax, Bak und Bok mittels Western Blot und Immunfluoreszenzmikroskopie analysiert werden. Schließlich sollte der Einfluss des spezifischen Verlustes der MDPs auf die Wirksamkeit von Venetoclax und Bortezomib analysiert werden. Hierfür wurden mittels CRISPR/Cas9 generierte Bax, Bak und Bok knock-out Zellen mit Venetoclax und/oder Bortezomib inkubiert und nachfolgend die Expression pro- und anti-apoptotischer Proteine sowie die Effektivität der Apoptoseinduktion untersucht. Bei gleicher Dosierung bewirkte die Kombination von Bortezomib mit dem Bcl-2-Inhibitor Venetoclax die höchsten Zelltodraten (Venetoclax&Bortezomib: > 80% (SW982/wt, SK-LMS-1) bzw. ~70% (RD) avitale Zellen), während die Kombination mit dem Bcl-xL-Inhibitor A-1155463 geringere Zelltodraten (A-1155463&Bortezomib: < 45% (SW982/wt, RD) bzw. ~60% (SK-LMS-1) avitale Zellen) und mit dem Mcl-1-Inhibitor A-1210477 einen vernachlässigbaren Anteil apoptotischer Zellen (A-1210477&Bortezomib: < 25% avitale Zellen in SW982/wt, RD und SK-LMS-1) induzierte. Die synergistische Apoptoseinduktion war somit in der gewählten Dosierung von 15 µM BH3-Mimetikum und 5 nM Bortezomib spezifisch für Bortezomib und eine Bcl-2-Inhibition. Nach Inkubation mit Venetoclax&Bortezomib zeigten sich in allen getesteten Zelllinien erhöhte Expressionen von Mcl-1 und Noxa sowie erhöhte Bok- und Bak-Level in SW982/wt. In SW982/wt resultierte die Inkubation mit Venetoclax&Bortezomib zudem in einer mitochondrialen Clusterbildung von Bax, Bak und Bok. Die Regulation der Expression pro- und anti-apoptotischer Proteine war in den knock-out Zellen im Vergleich zur Wildtypzelllinie unverändert, jedoch war bei einem Bax knock-out die Zelltodinduktion durch Venetoclax&Bortezomib auf unter 50% reduziert. Dies lässt auf eine zentrale Rolle von Bax in der Venetoclax&Bortezomib-induzierten Apoptose schließen. Basierend auf unseren Ergebnissen und bestehender Literatur schlagen wir vor, dass der Synergismus von Venetoclax und Bortezomib auf der simultanen Inhibition der Bcl-2/BaxAchse durch Venetoclax und der Mcl-1/Bak&Bok-Achse durch Bortezomib-induzierte Noxa und Bok Hochregulierung beruht. Das Überwiegen proapoptotischer Faktoren resultiert letztendlich über die Aktivierung der drei MDPs Bax, Bak und Bok in Apoptose. Diese in vitro Arbeit liefert Hinweise einer möglichen Wirksamkeit von Venetoclax in Kombination mit Bortezomib bei der Therapie von Sarkompatienten. Beide Medikamente sind bereits für die Behandlung anderer Krebsentitäten im Menschen zugelassen und die Kombination aus Venetoclax plus Bortezomib und Dexamethason wird momentan in einer Phase 3 Studie in Patienten mit Multiplem Myelom getestet (Bellini, NCT02755597). Eine Kombinationstherapie mit Venetoclax und Bortezomib stellt wegen der hier dargestellten starken Apoptoseinduktion in Sarkomzelllinien auch bei der Behandlung von Sarkomen einen vielversprechenden Ansatz dar und könnte so bei synergistischer Wirkung zu einer Verbesserung der 5-Jahres-Überlebensraten führen