Mécanismes d'élimination des ribonuclétides de l'ADN chez les Archaea

Ribonucleotides (rNMPs) are the main non-canonical nucleotides into genomic DNA. Embedded rNMPs in DNA can be used as a positive signal. However, if rNMPs are not removed from the DNA they can cause genomic instabilities.One of the main rNMP incorporation source into DNA are the DNA polymerases of the three domains of life. Our models, the Archaea Pyrococcus abyssi and Thermococcus barophilus possess 2 replicative DNA polymerases belonging to the Bfamily (PolB) and the D-family (PolD). We aimed to study the removal mechanisms of embedded ribonucleotides in DNA. First, we studied the contribution of proofreading exonuclease activity of PolB and PolD on rNMP processing. The results indicate that the 3’-5’ exonuclease activity of PolD is more efficient in editing newly inserted rNMP at terminal primers than PolB. According to our structural data, this difference cannot be accounted by physical constraint of rNMP into the exonuclease active site. We then studied the archaeal Ribonucleotide Excision Repair (RER) pathway in vitro and in vivo. Our data demonstrate that RER pathway is efficient to correct both matched and mismatched rNMP. Both PolB and PolD can be involved in RER, PolB is more efficient for matched rNMP removal whereas PolD seems more efficient to correct mismatched rNMP. We also suggested an alternative RER pathway involving the 5’-3’ exonuclease activity of Fen1. Finally, we determined the intracellular nucleotide concentration of Thermococcus barophilus, Haloferax volcanii and their relative RNase H mutants to assess the effect of RNase HII deletion on the nucleotide pool variation.Les ribonucléotides (rNMPs) sont les dommages à l’ADN les plus fréquents. Lorsqu’ils sont incorporés dans l’ADN les rNMPs peuvent avoir un rôle bénéfique de signal. En revanche, s’ils ne sont pas éliminés de l’ADN, ils peuvent causer des instabilités génomiques. Une des principales sources d’incorporation des rNMPs dans l’ADN sont les ADN polymérases dans les trois domaines du vivant. Nos modèles, les Archaea Pyrococcus abyssi et Thermococcus barophilus, possèdent 2 ADN polymérases réplicatives appartenant à la famille B (PolB) et à la famille D (PolD).Notre objectif est d’étudier les mécanismes permettant l’élimination des rNMPs de l’ADN. Premièrement, nous avons étudié la contribution de l’activité exonucléase de PolB et PolD pour l’élimination des rNMPs. Les résultats montrent que l’activité 3’-5’ exonucléase de PolD est plus efficace pour corriger des rNMPs nouvellement incorporés à l’extrémité des amorces comparativement à PolB. Selon nos données de structure, cette différence n’est pas due à une contrainte physique du rNMP dans le site actif exonucléase. Nous avons ensuite étudié la voie de réparation par excision des ribonucléotides (RER) des Archaea in vitro et in vivo.Nos résultats démontrent que la voie RER est efficace pour corriger les rNMPs appariés et mésappariés. PolB et PolD peuvent être impliquées dans la voie RER, PolB est plus efficace pour l’élimination d’un rNMP apparié alors que PolD serait plus efficace pour corriger un rNMP mésapparié. Nous avons également proposé une voie RER alternative impliquant l’activité 5’-3’ exonucléase de Fen1.Pour finir, nous avons déterminé les concentrations des nucléotides intracellulaires de Thermococcus barophilus, Haloferax volcanii et de leur mutants RNase H afin d’évaluer une possible variation du contenu en nucléotides