Potencial neuroprotetor de compostos naturais marinhos de macroalgas num modelo celular da doença de Alzheimer

O aumento da esperança média de vida tem levado ao aumento da população idosa, originando uma prevalência de doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer. Até ao momento, não foi encontrado um tratamento eficaz contra esta e, por isso, é importante procurar novas soluções terapêuticas. Assim, o objetivo desta dissertação foi implementar um modelo de stress oxidativo induzido com peróxido de hidrogénio (H2O2) em células SH-SY5Y e avaliar o potencial protetor de compostos marinhos isolados de macroalgas, assim como os biomarcadores associados aos efeitos neuroprotetores demonstrados. Os compostos foram isolados por técnicas cromatográficas, cujas estruturas foram elucidadas por 1H-RMN e GC-MS. A capacidade anti-enzimática dos compostos foi avaliada na atividade da enzima AChE e BACE-1. A citotoxicidade do H2O2 (1 – 10 000 μM) e dos compostos (0,01 – 100 μM) foi avaliada nas células SH-SY5Y, após 24 h de incubação, e os efeitos foram estimados pelo método MTT. A avaliação do potencial neuroprotetor foi avaliada através da indução de citotoxicidade com o H2O2 (200 μM). De modo a compreender as vias de sinalização envolvidas na atividade citoprotetora, biomarcadores celulares foram estudados, nomeadamente quantificação de espécies reativas de oxigénio, alterações do potencial de membrana mitocondrial e atividade da Caspase-3. Foram isolados três compostos identificados como eleganolone, loliolide e sphaerococcenol A a partir das macroalgas Bifurcaria bifurcata, Codium tomentosum e Sphaerococcus coronopifolius. Para além destes, três compostos hemi-sintéticos análogos do sphaerococcenol A (compostos 1, 5 e 6) foram também estudados. Foi utilizado ainda o D-manitol e o α-tocoferol. Em relação à atividade enzimática, a maioria dos compostos apresentaram capacidade de inibição da enzima BACE-1. Contudo, nenhum composto apresentou capacidade de inibição da enzima AChE. Nos ensaios de citotoxicidade o H2O2 (100 – 10 000 μM) demonstrou reduzir entre 40-50% a viabilidade celular. Na presença dos compostos às concentrações não tóxicas, verificou-se que o sphaerococcenol A, composto 6 e D-manitol sem pré-incubação e quando pré-incubado apresentaram capacidade de reduzir a citotoxicidade. No que respeita ao estudo dos mecanismos de ação, verificou-se que o tratamento induzido com H2O2 causou aumento da atividade da Caspase-3, que foi revertido, mais marcadamente, pelo composto 6. Os compostos sphaerococcenol A e D-manitol com pré-incubação preveniram a diminuição da disfunção mitocondrial induzida pela exposição ao H2O. No ensaio de produção de espécies reativas de oxigénio, não se verificou diferenças estatísticas entre os compostos e o H2O2. Em suma, os resultados demonstraram o potencial dos compostos sphaerococcenol A, composto 6 e D-manitol como os mais promissores, diminuindo a atividade da enzima BACE-1 e apresentando efeito citoprotetor nas células neuronais contra o H2O2. Este efeito pareceu ser mediado por redução da atividade da Caspase-3 e prevenção da alteração do potencial de membrana mitocondrial. Os dados indicam assim que estes apresentam potencial como agentes terapêuticos em células do neuroblastoma humano, podendo ser considerados para a realização de mais estudos de modo a compreender o seu potencial terapêutico no tratamento da DA.The increase in average life expectancy has led to an increase in the elderly population, leading to a prevalence of neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease. So far, an effective treatment against it has not been found and, therefore, it is important to look for new therapeutic solutions. Thus, the objective of this dissertation was to implement a model of oxidative stress induced with hydrogen peroxide (H2O2) in SH-SY5Y cells and to evaluate the protective potential of marine compounds isolated from macroalgae, as well as the biomarkers associated with the demonstrated neuroprotective effects. The compounds were isolated by chromatographic techniques, whose structures were elucidated by NMR GC-MS. The anti-enzymatic capacity of the compounds was evaluated un the AChE and BACE-1 enzyme activity. The cytotoxicity of H2O2 (1 – 10 000 μM) and compounds (0,01 – 100 μM) was evaluated in SH-SY5Y cells, after 24 h of incubation, and their effects estimated by MTT method. The evaluation of the neuroprotective potential of the compounds was through the induction of cytotoxicity with H2O2 (200 μM). In order to understand the signaling pathways involved in the cytoprotective activity, cellular biomarkers were studied, namely quantification of reactive oxygen species, changes in mitochondrial membrane potential and Caspase-3 activity were evaluated. Three compounds identified as eleganolone, loliolide and sphaerococcenol A were isolated from the macroalgae Bifurcaria bifurcata, Codium tomentosum and Sphaerococcus coronopifolius. In addition to these, three hemi-synthetic compounds analogous to sphaerococcenol A (compounds 1, 5 and 6), were also tested. D-mannitol and α-tocopherol were also used. Regarding the enzymatic activity, most of the compounds inhibited the BACE-1 enzyme activity. On the other hand, no compound showed activity against AChE enzyme. Regarding cytotoxicity assays, H2O2 (100 – 10 000 μM; 24 h) reduced significantly the cell viability of SH-SY5Y cells. In the presence of the compounds at non-toxic concentrations, it was found that sphaerococcenol A, compound 6 and D-mannitol without pre-incubation and when pre-incubated were able to reverse the cytotoxicity induced by H2O2. Regarding the study of the mechanisms of action involved, it was found that the treatment induced with H2O2 stimulated Caspase-3 activity, which was markedly reversed by the treatment with compound 6. The compounds phaerococcenol A and D-mannitol with pre-incubation prevented the decrease in mitochondrial dysfunction induced by exposure to H2O2.Concerning the production of reactive oxygen species, no significant differences between the compounds and H2O2 were observed. In summary, the results demonstrated the potential of sphaerococcenol A, compound 6 and D-mannitol as the most promising compounds, decreasing the activity of the BACE-1 enzyme and presenting a cytoprotective effect on neuronal cells against cytotoxicity induced by H2O2 treatment. Their effects seem to be mediated by a reduction of Caspase-3 activity and prevention of mitochondrial membrane potential change. The data here attained indicates the neuroprotective potential of these compounds, which should be considered for further studies in order to understand their therapeutic potential in the treatment of AD