Imunocitoquímica e hibridização in situ na microscopia eletrônica : metodologia complementar na caracterização de vírus e viróides

Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 1994.A virologia foi, provavelmente, um dos campos que mais se beneficiou com a introdução do microscópio eletrônico como ferramenta de pesquisa. A microscopia eletrônica desempenha um importante papel na caracterização dos vírus, fornecendo dados sobre a morfologia das partículas e citopatologia. Estes dados podem contribuir para complementar a caracterização viral e consolidar a taxonomia dos mesmos, além de ser um importante auxiliar na diagnose da doença. Estes benefícios da microscopia eletrônica se estendem naturalmente à virologia vegetal. Tecidos de plantas infectados por vírus, quando observados ao microscópio eletrônico, podem apresentar efeitos citopáticos típicos que geralmente incluem o aparecimento dos corpúsculos de inclusão. Estas inclusões podem ser formadas por partículas virais ou estruturas induzidas pela infecção viral, presentes no citoplasma ou núcleo das células infectadas. No citoplasma, estas inclusões podem estar representadas por partículas virais, proteínas não estruturais ou alterações celulares, ou mesmo uma mescla de todos eles. No núcleo, as inclusões podem estar relacionadas com o nucléolo, presentes no nucleoplasma ou espaço perinuclear. Contudo, diversas são as limitações das técnicas convencionais e histologia ultraestrutural para se identificar de forma inequívoca os virions, a natureza de certas inclusões ou mesmo a localização de ácidos nucleicos envolvidos no processo da infecção viral. Diante destes aspectos, técnicas auxiliares como a imunocitoquímica e a hibridização in situ muitas vezes podem ser capazes de solucionar estes problemas. A imunocitoquímica tem por finalidade localizar proteínas através da identificação de sítios onde se dá a reação antígeno-anticorpo e sua visualização através de um marcador - o ouro coloidal. Já a hibridização in situ, consiste no fenômeno do pareamento de bases entre dois ácidos nucleicos complementares, um dos quais se acha marcado e funciona como sonda molecular. Este trabalho teve por objetivo estabelecer um protocolo básico para imunocitoquímica e hibridização in situ de vírus e viróides de plantas, respectivamente em nossas condições. Os resultados de ensaios imunocitoquímicos com vírus pertencentes aos grupos tospovirus, potyvirus, rhabdovirus, ilarvirus, tobravirus, tymovirus e potexvirus permitiram a detecção dos antígenos de proteínas estruturais e não estruturais destes vírus demonstrando a consistência do método. A detecção de ácidos nucleicos pela hibridização in situ permitiu a localização de RNAs do "avocado sunblotch viroid ’-ASBVd nos cloroplastos indicando a probabilidade de ser este o sítio de replicação deste viróide .Virology was one of the area of biological sciences most benefited by the introduction of the electron microscopy as a research tool. Electron microscopy has an important role in virus characteri zation, providing informations on particle morphology and cytopatology. These data can help to complement viral characterization, orient their taxonomy, and on the praticai aspects contributing to the disease diagnosis. In this context, plant virology was also strongly formed by electron microscopy during progress. Virus infected plant tissues observed in electron microscopy may present typical cytopathic effects among which the common is the appearance of inclusion bodies. These inclusions can be formed by viral particles or structures produced by the viral infection, and be present in the infected cells cytoplasm or nucleus. These inclusions present in the citoplasm can be viral particles, non structural proteins or cellular modifications or even a mixture of them. In the nucleus, these inclusions can be related to the nucleolus, present in the nucleoplasm or in the perinuclear space. However, the conventional ultrastructural procedures have several limitations to identify virions and the nature of inclusions and to identify and localize virus related nucleic acids. Considering these 1 imitat ions, complementary techniques as immunocytochemistry and in situ hibridization has been developed to solve part of these problems. The aim of immunocytochemistry is the localization of viral proteins detected by specific antibodies, and the sites of antigenantibody reaction are visualized by coloidal gold particles used as markers. The in situ hybridization consists in the detection of a given nucleic acid by its pairing with a complementary strand (molecular probe), labeiled such way that it can be traced indirectly with a colloidal gold traced marker. The aim of the present studie was to establish a basic protocol to apply immunocytochemistry and in situ higbridization of plants virus and viroids, respectively under our conditions. Immunoctytochemical assays were caried out with representatives of tospovirus, potyvirus, rhabdovirus, ilarvirus, tobravirus, tymovirus and potexvirus groups and permitted thus detection of either structural and non structural viral proteins demonstrating the sensibility of the method employed. On the the other hand, in situ hybridization enabled the localization of the avocado sunblotch viroid-ASBVd RNAs in the cloroplast indicating that this organele may be the replication site of this viroid