Non-ribosomal peptide synthetase engineering focusing on the condensation domain and the condensation/adenylation domain interface

Non-ribosomal peptide synthetases (NRPSs) are modular biosynthetic megaenzymes producing many important natural products and refer to a specific set of peptides in bacteria’s and fungi’s secondary metabolism. With the actual purpose of providing advantages within their respective ecological niche, the bioactivity of the structurally highly diverse products ranges from, e.g., antibiotic (e.g., vancomycin) to immunosuppressive (e.g., cyclosporin A) to cytostatic (e.g., echinomycin or thiocoralin) activity. An NRPS module consists of at least three core domains that are essential for the incorporation of specific substrates with the 'multiple carrier thiotemplate mechanism' into a growing peptide chain: an adenylation (A) domain selects and activates a cognate amino acid; a thiolation (T) domain shuffles the activated amino acid and the growing peptide chain, which are attached at its post-translationally 4ʹ-phosphopantetheine (4'-PPant) group, between the active sites; a condensation (C) domain links the upstream and downstream substrates. NRPS synthesis is finished with the transfer of the assembled peptide to the C-terminal chain-terminating domain. Accordingly, the intermediate is either released by hydrolysis as a linear peptide chain or by an intramolecular nucleophilic attack as a cyclic peptide. The NRPS’s modular character seems to imply straightforward engineering to take advantage of their features but appears to be more challenging. Since the pioneering NRPS engineering approaches focused on the reprogramming and replacement of A domains, several working groups developed advanced methods to perform a complete replacement of subdomains or single or multiple catalytic domains. The first part of this work focusses parts of the publication with the title 'De novo design and engineering of non-ribosomal peptide synthetases', which follows up assembly line engineering with the development of a new guideline. Thereby, the pseudodimeric V-shaped structure of the C domain is exploited to separate the N-terminal (CDSub) and C-terminal (CASub) subdomains alongside a four-AA-long linker. This results in the creation of self-contained, catalytically active CASub-A-T-CDSub (XUC) building blocks. As an advantage over the previous XU concept, the characteristics (substrate- and stereoselectivity) assigned to the C domain subunits are likewise exchanged, and thus, no longer represent a barrier. Furthermore, with the XUC concept, no important interdomain interfaces are disrupted during the catalytic cycle of NRPS, allow to expect much higher production titers. Moreover, the XUC concept shows a more flexible application within its genus origin of building blocks to create peptide libraries. Additionally, with this concept only 80 different XUC building blocks are needed to cover the entire proteinogenic amino acid spectrum. The second part of this work addresses the influence of the C domain on activity and specificity of A domains. In a comprehensive analysis, a clear influence of different C domains on the in vitro activation rate and the in vivo substrate spectrum could be observed. Further in situ and in silico characterizations indicate that these influences are neither the result of the respective A domains promiscuity nor the C domain’s proofreading, but due to an 'extended gatekeeping' function of the C domain. This novel term of an 'extended gatekeeping' function describes the very nature of interfaces that C domains can form with an A domain of interest. Therefore, the C-A interface is assumed to have a more significant contribution to a selectivity filter function. The third part of this work combines the NRPS engineering with phylogenetic/evolutionary perspectives. At first, the C-A interface could be precisely defined and further identified to encode equivalent information corresponding to the complete C-A didomain. Moreover, the comparison of NRPSs topology reveals hints for a co-evolutionary relatedness of the C-A didomain and could be shown to reassemble even after separation. In this regard, based on a designed CAopt.py algorithm, the reassembling-compatibility of hybrid interfaces could be determined by scoring of the co-expressed NRPS hybrids. This algorithm also enables the randomization of the interface sequences, thus, leading to the identification of more functional interface variant, which cause significantly higher peptide production and could even be applied to other native and hybrid interfaces.Nicht-Ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind modular aufgebaute biosynthetische Megaenzyme, die Peptide mit hoher struktureller und bioaktiver Diversität produzieren. Dabei bilden sie eine spezifische Gruppe von Peptiden im Sekundärstoffwechsel von Bakterien und Pilzen. Mit dem eigentlichen Zweck, Vorteile innerhalb ihrer jeweiligen ökologischen Nische zu ermöglichen, erstreckt sich die Bioaktivität der vielfältigen Produkte von z.B. antibiotischer (z.B. Vancomycin) über immunsuppressiver (z.B. Cyclosporin A) bis hin zu zytostatischer (z.B. Echinomycin oder Thiocoralin) Aktivität. Nicht-ribosomale Peptide (NRPs) oder die von NRPs abgeleiteten Peptide stellen daher eine wichtige Klasse pharmazeutisch relevanter Wirkstoffe dar, die über die letzten Jahrzehnte in der klinischen Anwendung etabliert werden konnten. Die Synthese von nicht-ribosomalen Peptide ist in einer modularen fließbandähnlichen Logik organisiert, bei dem jedes Modul für den Einbau einer bestimmten Aminosäure verantwortlich ist. Damit ist die Synthese nicht von der mRNA sondern von der Aminosäurespezifität, Anzahl und Organisation der Module anhängig. Trotz determinierter Modulabfolge lassen sich NRPS nach ihrer biosynthetischen Logik in lineare NRPS (Typ A), iterative NRPS (Typ B) und nichtlineare NRPS (Typ C) einordnen. Gemeinsam ist allen jedoch, dass sie den Einbau spezifischer Substrate in eine wachsende Peptidkette durch den „multiple carrier thiotemplate mechanism“ katalysieren. Ein NRPS Modul besteht aus mindestens drei Kern-Domänen: Einer Adenylierungs (A) Domäne, die ein passendes Substrat erkennt und aktiviert; einer Thiolierungs (T) Domäne die aktivierten Aminosäuren bzw. die wachsende Peptidkette, die an ihrer posttranslationalen 4'-PPant-Gruppe gebunden ist, zwischen den aktiven Stellen hin und her befördert; und einer Kondensations (C) Domäne, die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Substrate verbindet und eine Kontrollfunktion der Substrat- und Stereoselektivität einnimmt. Im Anschluss an diese Kern-Domänen wird das assemblierte Peptid auf eine endständige Terminationseinheit übertragen und kann entweder durch Hydrolyse als lineare Peptidkette oder durch ein intramolekulares Nukleophil als zyklisches Peptid freigesetzt werden. Der modulare Charakter der NRPS scheint eine simple Veränderung der Enzyme zu erlauben. Diese Vorteile für das rational Design neuartiger Naturstoffe zu nutzen, hat sich jedoch als eine größere Herausforderung herausgestellt. Seit den ersten NRPS-Engineering Ansätzen, die sich auf die Umprogrammierung und den Untereinheitenaustausch von A Domänen konzentrierten, haben mehrere Arbeitsgruppen fortgeschrittene Methoden entwickelt, um einen vollständigen Austausch von einzelnen Untereinheiten oder Domänen und sogar mehreren katalytischen Domänen durchzuführen. Der erste Teil beschäftigt sich mit Teilen der Publikation mit dem Titel „De novo design and engineering of non-ribosomal peptide synthetases“ und knüpft an die Neukombination von NRPS mit der Entwicklung einer neuartigen NRPS-Engineering Strategie an. Dabei wird die pseudeodimere, V-artige Struktur der C Domäne ausgenutzt, um diese entlang eines vier-Aminosäure-langen Linkers zwischen den N-terminalen (CDSub) und C-terminalen (CASub) Untereinheit zu teilen. Dadurch entstehen, entsprechend der Schnittstellenposition in der C Domäne, s.g. eXchange Unit Condensation domain (XUC) Bausteine. XUC Bausteine sind katalytisch eigenständige CASub-A-T-CDSub Einheiten, die die Eigenschaften der flankierenden C Domänen Untereinheiten mit austauschen. Dadurch wird ein flexibles System geschaffen, das die C Domänen Spezifitäten integriert und die Zahl der NRPS-Bausteine, die zur Herstellung oder Veränderung bestimmter Peptide erforderlich sind, drastisch reduziert. Es sind mit dem XUC Konzept nur 80 verschiedene XUC Bausteine (unter Berücksichtigung der N- und C-terminaler C- oder dualer C/E Domänen) benötigt, um das gesamte Spektrum aller 20 proteinogene Aminosäuren abzudecken. Ein großer Vorteil dieses Konzepts ist, dass keine Interdomänengrenzflächen verändert werden, was höhere Produktionstiter der generierten Hybride erwarten lässt. Dies ermöglicht die effiziente Herstellung von Peptiden, die auch nicht natürliche Aminosäuren enthalten, mit Ausbeuten von bis zu 280 mg/l. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass sich sogar die relaxierte Substratspezifität des GameXPeptide (GxpS) Moduls 3 als XUC Baustein auf das Xenotetrapeptid (XtpS) übertragen lassen. Somit konnten durch Fütterung unnatürlicher Aminosäuren wie O-Propargyl-L-Tyr, p-Bromo-L-Phe oder p-Azido-L-Phe eine Produktion der jeweiligen XtpS Derivate beobachtet werden. Weiterhin ermöglicht die einmalige, auf Hefe basierende transformationsassoziierte Rekombination (TAR) die Erstellung umfassende Peptid Peptidbibliotheken..