Development of new steroidal oximes as possible anticancer drugs

Cancer is a leading cause of death worldwide, accounting for nearly 10 million deaths in 2020. Therefore, it is urgent to find new anticancer treatments. This work aimed to develop new steroidal oximes of the estrane series with potential antitumor interest. For this, several intermediates and respective C17 oximes were synthesized by reaction of hydroxylamine with the 17-ketone of estrone derivatives. Then, their cytotoxicity was evaluated in six cell lines (MCF-7, T47-D, LNCaP, HepaRG, Caco-2 and NHDF) by the 3‐(4,5‐dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Estrogenicity assays, cell cycle distribution analysis and fluorescence microscopy studies with Hoechst 33258 staining were also performed for the most promising compounds. In addition, molecular docking against estrogen receptor α (ERα), steroid sulfatase, 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 and β-tubulin were also accomplished. Computational predictions of their pharmacokinetics and toxicity properties were also performed. Δ9,11-estrone has been shown to be cytotoxic against HepaRG cancer cells (IC50 = 6.67 μM) and promoted a cell cycle arrest at G0/G1 phase. Estrogenic activity was also observed for this compound at 0.1 μM in T47-D cells and molecular docking studies estimated a marked interaction between this compound and ERα. The presence of a 16E-benzylidene group increased the antiproliferative effect on MCF-7 and T47-D cells. Moreover, the introduction of iodine in positions 2 and 4 of estrone seemed to induce a selective cytotoxicity for HepaRG cells. The 9α-hydroxy,11β-nitrooxyestrone derivative markedly reduced HepaRG cells viability (~92%) and 9α-hydroxyestrone acetate exhibited a selective antiproliferative effect on HepaRG cells, inducing a cell cycle arrest at G0/G1, and did not promote an estrogenic effect on T47-D cells. Docking studies estimated a generally lower affinity of C-ring oxidized compounds to ERα. Estrone p-quinol (10β-hydroxyestra-1,4-diene-3,17-dione) displayed marked cytotoxic activity, particularly against hormone-dependent cancer cells and the flow cytometry analysis revealed that this compound markedly reduced the viability of HepaRG cells. Molecular docking studies suggested a high affinity towards ERα and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1. Moreover, it was predicted that this molecule has a good oral bioavailability and a low maximum tolerated dose in humans. Concerning oximes, six steroidal oximes in estrane series were synthesized, five of which for the first time. The 2-nitroestrone oxime showed higher cytotoxicity than the parent compound on MCF-7 cells. Furthermore, the oximes bearing halogen groups in A-ring evidenced selectivity for HepaRG cells. Remarkably, the Δ9,11-estrone oxime was the most cytotoxic and arrested LNCaP cells in the G2/M phase. Fluorescence microscopy studies showed the presence of condensed DNA typical of prophase and condensed and fragmented nuclei characteristic of apoptosis. However, this oxime promoted the proliferation of T47-D cells. Interestingly, molecular docking studies estimated a strong interaction between Δ9,11-estrone oxime and ERα and β-tubulin, which may account for the described effects. Thus, the presence of an oxime group at C17 in functionalized estrone scaffold showed to be a good strategy to obtain new molecules with potential anticancer effects.O cancro é uma das principais causas de morte em todo o mundo, responsável por quase 10 milhões de mortes em 2020. Os dados apresentados em 2020 pelo GLOBOCAN (Agência Internacional de Investigação sobre o Cancro) mostraram que o cancro do pulmão foi a principal causa de morte por cancro, com uma estimativa de 1,8 milhões de mortes (18%), seguido pelo cancro colorretal (9,4%), cancro do fígado (8,3%), cancro do estômago (7,7%) e cancro da mama feminino (6,9%). A indústria farmacêutica tem trabalhado arduamente para desenvolver novas terapêuticas anticancerígenas, com maior seletividade e melhor perfil de segurança, permitindo um aumento na sobrevida e qualidade de vida dos doentes. Em geral, a terapêutica hormonal é altamente eficaz contra os cancros hormono-dependentes e é bem tolerada. Assim, ao longo dos anos, muitas moléculas esteroides foram sintetizadas e testadas contra diferentes células tumorais na tentativa de se identificarem novos candidatos a fármacos anticancerígenos. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver novas oximas esteroides, da série estrano, com potencial interesse antitumoral. Para isso, foram sintetizados vários intermediários, os quais foram usados na síntese de oximas em C17 através da reação da hidroxilamina com a 17-cetona dos derivados da estrona. Depois de sintetizados, todos os compostos foram purificados e caracterizados através de espetros de infravermelho e de ressonância magnética nuclear (protão e carbono-13); os espetros de massa de alta resolução também foram obtidos para os novos compostos. Posteriormente, a citotoxicidade foi avaliada em seis linhas celulares [mama (MCF-7, T47-D), próstata (LNCaP), fígado (HepaRG), intestino (Caco-2) e fibroblastos da derme (NHDF)] através do ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Também foram efetuados ensaios de estrogenicidade em células T47-D, bem como a análise de distribuição do ciclo celular e de microscopia de fluorescência com Hoechst 33258 para os compostos mais promissores. Estudos in silico de docking molecular foram realizados contra o recetor de estrogénios α (ERα), a esteroide sulfatase, a 17β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 1 e a β-tubulina. As previsões computacionais das propriedades farmacocinéticas e de toxicidade também foram obtidas e estudadas. A redução mais relevante da proliferação celular foi observada com os compostos Δ9,11-estrona em células HepaRG, com a oxima da Δ9,11-estrona em células LNCaP e com o acetato de 9α-hidroxi-11β-nitrooxiestrona em células dependentes de hormonas (MCF-7, T47-D e LNCaP). A Δ9,11-estrona mostrou citotoxicidade contra as células cancerígenas HepaRG (IC50 = 6,67 μM) promovendo a paragem do ciclo celular na fase G0/G1. A atividade estrogénica foi observada para este composto a 0,1 μM nas células T47-D e os estudos de docking molecular estimaram uma interação interessante entre este composto e o ERα. A presença do grupo 16E-benzilideno, nos derivados da estrona, aumentou o efeito antiproliferativo nas células MCF-7 e T47-D. A introdução do grupo iodo nas posições 2 e 4 da estrona pareceu induzir uma citotoxicidade seletiva para as células HepaRG. No entanto, a presença de iodo e bromo nas posições 2 e 4 da Δ9,11-estrona não foi uma alteração estrutural favorável para o desenvolvimento de potenciais agentes antiproliferativos. Já a presença simultânea dos grupos 9α-hidroxi e 11β-nitrooxi no acetato de estrona reduziu marcadamente a viabilidade das células HepaRG (~92%). O acetato de 9α-hidroxiestrona exibiu um efeito antiproliferativo seletivo nas células HepaRG, induzindo a paragem do ciclo celular em G0/G1 e não promoveu um efeito estrogénico nas células T47-D. O docking molecular estimou uma afinidade geralmente mais baixa dos compostos oxidados no anel C para o ERα. O derivado p-quinol da estrona (10β-hidroxiestra-1,4-dieno-3,17-diona) exibiu atividade citotóxica marcada, particularmente contra células hormono-dependentes e a análise dos estudos de citometria de fluxo revelou que este composto reduziu significativamente a viabilidade das células HepaRG. O docking molecular mostrou uma alta afinidade para o ERα e para a 17β-hidroxiesteroide desidrogenase tipo 1. Além disso, foi predito que esta molécula tem uma boa biodisponibilidade oral e uma dose máxima tolerada baixa em humanos. Relativamente às oximas, foram sintetizadas seis oximas da série estrano, cinco das quais pela primeira vez. A 2-nitroestrona-17-oxima mostrou maior citotoxicidade que o composto original nas células MCF-7. Além disso, as oximas que continham grupos halogénio no anel A evidenciaram seletividade para as células HepaRG. Notavelmente, a Δ9,11-estrona-17-oxima foi a mais citotóxica para as células LNCaP e induziu a paragem do ciclo celular na fase G2/M. Os estudos de microscopia de fluorescência mostraram a presença de DNA condensado típico da prófase e núcleos condensados e fragmentados característicos da apoptose. No entanto, esta oxima promoveu a proliferação das células T47-D. Os estudos de docking molecular estimaram uma forte interação entre a Δ9,11-estrona-17-oxima e o ERα e a β-tubulina, o que pode justificar os efeitos citotóxicos descritos. Em suma, a presença de um grupo oxima em C17 no núcleo da estrona mostrou ser uma boa estratégia para a obtenção de novas moléculas com potenciais efeitos anticancerígenos