Les solutions pour prévenir de la génotoxicité du système CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 system has revolutionized genetic world. Nowadays, it is used in various research domains as medicine, agronomy, environment… It is also involved in clinic. However, for a few years, more and more studies have underlined the Cas9 genotoxicity risks. As the first studies focused on the system lack of specificity and on its off-target risks, solutions were brought. Now, new ascertainments emphasize the on-target genotoxic risks. Indeed, non-desired insertions / deletions at the locus in HDR experiments, sequence inversions, large chromosomic truncations were described. The thesis work presented here, aims at finding solutions against these on-target genotoxic risks. In a first time, we have developed solutions in cell lines and hematopoietic stem cells with the nickase system development, and then we have focused on human induced pluripotent stem cells with the use of an allele-specific guide. Finally, we have worked out in sensitive detection genotoxic risks system in immortalized diploid cells to characterized them better. Quality controls must be set up to a correct use of this new biologic revolutionary tool and its limits must be known to controlled them better.Le système CRISPR-Cas9 a révolutionné le monde de la génétique. Il est aujourd’hui utilisé dans de nombreux domaines de recherches comme la médecine, l’agronomie, l’environnement etc. Il commence également à être utilisé en clinique. Cependant, depuis quelques années, de plus en plus d’études soulignent les risques génotoxiques de la nucléase Cas9. Alors que les premières études s’intéressaient au manque de spécificité et aux risques hors cibles du système et que des solutions ont été apportées, les nouvelles constatations pointent du doigt les risques de génotoxicité au locus ciblé. En effet, des risques d’apparition d’insertions/délétions non voulue au locus lors d’expériences d’HDR, d’inversion de séquences, de larges délétions chromosomiques terminales ont été décrits. Le travail de thèse présenté ici a pour but de trouver des solutions contre ces évènements génotoxiques au locus ciblé. Dans un premier temps, nous avons développé des solutions dans les lignées cellulaires, et les cellules souches hématopoïétiques en développant le système nickase, puis nous nous sommes intéressés aux cellules humaines pluripotentes induites avec l’utilisation d’un guide allèle-spécifique. Enfin, nous avons mis au point un système sensible de détection des risques génotoxiques dans des cellules diploïdes immortalisées afin de mieux les caractériser. Bien que très efficace, CRISPR-Cas9 nucléase reste un outil à optimiser. Des contrôles qualités doivent être mis en place pour une utilisation correcte de ce nouvel outil révolutionnaire pour la biologie et ses limites doivent être connues pour mieux les maitriser